بخشی از مقاله
چکیده
مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های کامن سال ا شری شیاکلی ازمو ضوعات مهم در کنترل بیماری های عفونی می با شد. این برر سی با هدف جدا سازی ژن های بتالاکتاماز و تعیین گروه فیلوژنتیکی جدایه های ا شری شیاکلی از مدفوع گو ساله های سالم دامداری های اطراف کرمان انجام شده است. . تعداد 171 سوآب مدفوع گوساله سالم زیر یک ماه از گاوداری¬های اطراف شهر ستان کرمان اخذ شد و پس از تایید بیو شیمیایی جدایه¬های ا شری شیاکلی، مورد برر سی مولکولی قرار گرفت.
آزمایش PCR جهت شناسایی ژن های blaTEM و blaSHV و blaOXA و blaCTX-15 انجام گرفت. همچنین آزمایش مولتی پلکس PCR جهت تعیین گروه های فیلوژنتیکی با شناسایی ژن های TSP4 , yja, chuAانجام گرفت. مشخص گردید که در 171 جدایه مورد مطالعه، 23 جدایه 13/45 - در صد - واجد یکی از ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی مورد نظر بوده ا ست که 20 جدایه 11/69 - درصد - دارای ژن blaTEM بوده و در گروه های فیلوژنی A و B1 انتشار داشتند 18 جدایه blaTEM مثبت از گروه A در تحت گروه های فیلوژنی A0 - 14 جدایه - و A1 - 4 جدایه - قرار داشت.
دو جدایه 1/17 - درصد - دارای ژن blaSHV بودند که هر 2 جدایه متعلق به گروه فیلوژنی A و تحت گروه فیلوژنی A0 بودند و یک جدایه 0/58 - درصد - دارای ژن blaCTX-15 بودند که در گروه فیلوژنی B1 قرار داشت. در حالی که هیچ یک از جدایه ها دارای ژن blaOXA نبودند. دو الگوی ترکیب ژن مقاومت آنتی بیوتیکی شامل blaTEM-blaSHV و blaTEM-blaSHV- blaCTX-15 به ترتیب در 2 جدایه از گروه های فیلوژنی A - تحت گروه A0 - و B1 بودند.
-1 مقدمه
باکتری اشریشیاکلی، که به طور طبیعی از دستگاه گوارش انسان و حیوان جداسازی می¬شود، از مهم¬ترین اعضای میکروبیوتا - فلور طبیعی - این دستگاه محسوب شده و سویه های پاتوژن آن طیف وسیعی از بیماری های خارج روده ای و اسهال را ایجاد می کنند.[14] امروزه با بروز مقاومت های دارویی در میان باکتری های بیماری زا، درمان این دسته از بیماری های عفونی با مشکلات فراوانی روبرو شده است.
از گذشته آنتی بیوتیک های بتالاکتام از درمان های رایج عفونت های باکتریایی محسوب می شوند باکتری ها با تولید آنزیم های بتالاکتاماز توانسته اند نسبت به این دسته از آنتی بیوتیک ها مقاوم شوند.
بتالاکتامازها از نظر بالینی مهمترین و وسیع ترین آنزیم های تخریب کننده ای هستند که به آنتی بیوتیک های بتا لاکتام حمله ور می شوند. حساسیت نسبت به داروهای- لاکتام بستگی به اتصال دارو به پروتئین هدف، مقاومت در برابر بتالاکتامازها و در باکتری های گرم منفی نفوذپذیری غشا دارد. در حالی که زیربنای اصلی مقاومت، غیر فعال شدن دارو به وسیله ی بتالاکتامازها است.
ژن های blaTEM از مهمترین ژن های بتالاکتامازی پلاسمیدی در باکتری های خانواده انتروباکتریاسه هستند که عامل بیش از 90 درصد مقاومت سویه های اشریشیاکلی به دارو های بتالاکتام و از علل مهم بروز مقاومت های چندگانه دارویی در عفونت های بیمارستانی می باشند
در ارزیابی تکامل ژنتیکی اشریشیاکلی، بررسی های فیلوژنتیکی از اهمیت خاصی برخوردار است. شناسایی گروه فیلوژنی سویه های اشریشیاکلی به روش PCR ، بواسطه تعیین حضور ژن های chuA، yjaA و همچنین قطعه ای از DNA تحت عنوان TSPE4 امکان پذیر می گردد.[9-13] ارتباط فیلوژنتیکی سویه های ECOR - مجموعه سویه های رفرانس اشریشیاکلی - نشان می دهد که سویه های اشریشیاکلی در چهار گروه اصلی فیلوژنی A، B1، B2 و D قرار می گیرند
بطور کلی به منظور افزایش دقت گروه بندی فیلوژنی و براساس حضور یا عدم حضور ژن های chuA، yjaA و TSPE4.C2 هفت تحت گروه فیلوژنی A1، A2، B1، B21، B23، D1 و D2 در سویه های اشریشیاکلی تعریف شده است.
متاسفانه در حال حاضر، مقاومت آنتی بیوتیکی در بسیاری از کشورها به عنوان یک مشکل بزرگ مطرح است. با توجه به افزایش روز افزون مقاومت های دارویی، انجام مطالعاتی در مورد تعیین الگوی مقاومت در زمان ها و مکان های مختلف جغرافیایی، امری ضروری و انکار ناپذیر می نماید. لذا شناسایی الگوی مقاومت های باکتری ها از جمله اشریشیاکلی نسبت به آنتی بیوتیک های شایع امری ضرورری به نظر می رسد.
ازاین رو هدف از این مطالعه شناسایی ژن های بتالاکتاماز ها و گروه های فیلوژنتیکی در جدایه های اشریشیاکلی به دست امده از مدفوع گوساله های سالم اطراف کرمان می باشد.
-2 مواد و روش ها
-2-1 جمع آوری نمونه
در این مطالعه از ابتدای بهار سال 1392 تا اول پاییز سال 1393، تعداد 171 نمونه سوآب از مدفوع گوساله های سالم زیر یک سال از گاوداری های اطراف شهر ستان کرمان اخذ شد. باکتری م شکوک به ا شری شیاکلی، از ک شت تمامی 171نمونه¬ی مدفوع جدا سازی شد و همگی تو سط ت ست های بیو شیمیایی تایید گردید و در نهایت مورد برر سی مولکولی قرار گرفت. برای ذخیره سازی، هر پرگنه¬ ی انتخابی در l 650 محیط LB براث استریل تعبیه شده در میکروتیوب های 1/5 میلی لیتری کشت داده شد و برای یک شب تا صبح در دمای °C37 نگهداری گردید. پس از طی این مدت در صورت مشاهده¬ی رشد به شکل کدورت، l 650 گلیسرول استریل 50 درصد به هر میکروتیوب اضافه شد و پس از ورتکس و کدگذاری در دمای °C20-ذخیره گردید.
-2-2 تعیین گروه فیلوژنتیکی
برای تعیین گروه های فیلوژنتیکی جدایه ها، نمونه ها تو سط پرایمر های معرفی شده در مطالعه¬ی کلرمونت و همکاران در سال 2000 به وسیله¬ی مولتی پلکس PCR مورد آزمایش قرار گرفتند.[4] توالی پرایمرها در جدول 1آورده شده است. از DNA استخراج شده¬ی سویه¬ی استاندارد EcoR62 به عنوان کنترل مثبت و اشریشیاکلی MG1655 به عنوان کنترل منفی در آزمایش PCR استفاده گردید.
جدول :1 پرایمر های مورد استفاده برای تعیین گروه های فیلوژنتیکی جدایه ها
-3-2 شناسایی ژن های blaSHV، blaTEM،blaOXA و blaCTX-15
جهت شنا سایی ژن های blaTEM و blaSHV از روش مولتی پلکس PCR با ا ستفاده از پرایمرهای اخت صا صی جدول 2 ا ستفاده گردید. از DNA ا ستخراج شده¬ی سویه¬ی ا ستاندارد کلب سیلا - Klebsiella 700603 - به عنوان کنترل مثبت ژن blaTEM و از سویه اشریشیاکلی - E. coli ATCC 35218 - به عنوان کنترل مثبت ژن blaSHV استفاده گردید. از سویه اشریشیاکلی - E. coli ATCC 25922 - به عنوان کنترل منفی استفاده گردید.
جدول :2 پرایمر های مورد استفاده برای شناسایی ژن های blaTEM و [16] blaSHV
