بخشی از مقاله
چکیده
هدف اصلی در این تحقیق، تعیین شیوع سویه های اشریشیاکلی تولید کننده ی شیگاتوکسین و انتروهموراژیک در فصول مختلف در بزهای ارجاع شده به کشتارگاه کرمان می باشد. مجموع 250 عدد جدایه از مدفوع و 233 عدد جدایهی متعلق به لاشهی بز از نظر حضور ژن های حدت stx1، stx2 و eae مورد ارزیابی قرار گرفت. فراوانی STEC در مدفوع و لاشه به ترتیب 16/4 و 5/6 درصد بود.
در منطقهی حاضر، بز را می توان به عنوان مخرن بالقوهی بدون علامت و انتشار دهندهی پاتوتیپ های STEC/EHEC در نظرداشت. فصل های دارای آلودگی بیشتر، شامل بهار و تابستان بود. پایش سویه های تولید کنندهی شیگاتوکسین در سیستم های بهداشتی مراکز تامین مواد غذایی مخصوصا با منشا دامی و افزایش سطح بهداشت این اماکن جهت کاهش آلودگی های مدفوعی مکررا توصیه می شود.
مقدمه
باکتری اشریشیاکلی تولید کنندهی شیگاتوکسین، یکی از مهم ترین پاتوژن های قابل انتقال از طریق غذا محسوب می شود. بیماری های انسانی از اسهال های خفیف تا خونی و سندرم همولیتیک اورمیک می تواند در نوزادان، کودکان و بزرگسالان به وقوع بپیوندد . - 1 - بیماری زایی اشریشیاکلی تولید کنندهی شیگاتوکسین در اصل به دلیل تولید دو سیتوتوکسین با نام های شیگاتوکسین1 و شیگاتوکسین2 می باشد که توسط دو ژن stx1 و stx2 کد می گردد . - 1 - جدایه های اشریشیاکلی تولید کنندهی شیگاتوکسین، علاوه بر عوامل حدت نام برده، می توانند دارای فاکتور های حدت دیگری نیز باشند.
برخی از این سویه های شیگاتوکسین می توانند دارای یک پروتئین بر روی غشای خارجی خود باشند که اینتیمین نام دارد و توسط ژنی با نام eae کد می گردد. باکتری به واسطهی این پروتئین قادر به اتصال به پرز های روده بوده و ایجاد ضایعاتی موسوم به ضایعات اتصالی و محوکننده می کند . - 2 - جدایه هایی از اشریشیاکلی تولید کنندهی شیگاتوکسین که -eaeمثبت هستند را اصطلاحا اشریشیاکلی خونریزی دهندهی روده ای یا اشریشیاکلی انتروهموراژیک می نامند.
تاکنون هیچ مطالعهی اپیدمیولوژیکی بر روی بز در منطقهی کرمان در مورد شیوع باکتری های مورد نظر در فصول مختلف، صورت نپذیرفته است. از این رو به دلیل نامعلوم بودن نقش بز در اپیدمیولوژی جدایه های اشریشیاکلی تولید کننده ی شیگاتوکسین و انتروهموراژیک و همچنین مصرف بالای گوشت این حیوان در منطقهی کرمان، انجام این پژوهش، دارای ضرورت ویژه ای است.
مواد و روش کار
در این مطالعه از ابتدای بهار سال 1394 تا اول بهار سال 1395، تعداد 250 نمونه مدفوع و 400 نمونه سوآپ از سطوح داخلی و خارجی 200 لاشهی بز در کشتارگاه شهرستان کرمان اخذ شد. باکتری مشکوک به اشریشیاکلی، از کشت تمامی 250 نمونهی مدفوع و از کشت 233 سوآب مربوط به لاشه، جداسازی شد و همگی توسط تست های بیوشیمیایی تایید گردید. در نهایت مجموع 483 جدایه 250 - عدد مدفوعی و 233 عدد به دست آمده از لاشه - مورد بررسی مولکولی قرار گرفت.
استخراج DNA به کمک روش NaOH بر روی یک پرگنه از کشت تازه در محیط LB آگار صورت پذیرفت. به طور خلاصه، ابتدا ذخیرهی گلیسرولهی جدایهی مورد نظر در محیط LB آگار در دمای 37°C کشت داده شد. پس از 24 ساعت پرگنهی مورد نظر با کمک سر سمپلر استریل از سطح محیط جامد برداشت شد و در NaOH 25 l نیم نرمال که در میکروتیوب های نیم میلی لیتری ریخته شده بود، حل گردید.
پس از مدت زمان 20 تا 30 دقیقه، به منظور توقف واکنش لیز سلول های باکتریایی، Tris-HCl 25 l یک مولار اضافه شد و سپس 450 l آب دو بار تقطیر استریل اضافه گردید. میکروتیوب ها به مدت یک دقیقه با سرعت 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و در نهایت به میزان 200 l از روی مایع برداشت و به میکروتیوب نیم میکرولیتری استریل دیگر منتقل گردید و برای انجام مراحل بعدی در دمای -20°C، فریز ونگهداری شد.
برای شناسایی سویه های EHEC/STEC از توالی پرایمرهای معرفی شده در مطالعهی چاینا و همکاران در سال 1996 به صورت مولتی پلکیس PCRٌ استفاده شد . - 3 - توالی پرایمرها در جدول 1 آورده شده است. حجم واکنش 25 O PCR بوده و غلظت اجزای آن شامل 2/5 O بافر 10x، 2mM منیزیم کلراید، dNTPs 0/2mM، 0/3 0 پرایمر، DNA 1U پلیمراز، DNA 5 O و آب مقطر تا حجم واکنش بود. تمامی اجزای تجاری واکنش از شرکت سیناکلون - ایران - تهیه گردید.
از DNA استخراج شدهی سویهی استاندارد ساکای - باکتری اشریشیاکلی - به عنوان کنترل مثبت و سویهی استاندارد اشریشیاکلی MG1655 به عنوان کنترل منفی در PCR استفاده گردید. برنامهی دمایی عبارت است از: 95œC برای 3 دقیقه، 38 سیکل شامل 95œC برای 1 دقیقه، 53œC برای 1 دقیقه و 72œC برای 1 دقیقه، پس از اتمام سیکل ها 72œC برای 10 دقیقه. در نهایت محصولات PCR الکتروفورز گردید و در صورت لزوم در دمای -20œC نگهداری شد.
نتایج
از میان 250 نمونه مدفوع و 400 نمونه سوآپ از سطوح داخلی و خارجی 200 لاشهی بز در کشتارگاه شهرستان کرمان، باکتری اشریشیاکلی، از کشت 250 نمونهی مدفوع و از کشت 233 سوآب مربوط به لاشه، جداسازی و توسط تست های بیوشیمیایی تایید گردید. از مجموع 483 جدایهی مورد آزمایش در روش PCR، 71 جدایه 14/7 - درصد - در یکی از پاتوتیپ های EHEC/STEC طبقه بندی شد که 50 مورد 20 - درصد - از آن ها مریوط به نمونه های مدفوعی و 21 مورد 9 - درصد - مربوط به نمونه های لاشه بود. در این مطالعه، بیشترین فراوانی سویه های تولید کنندهی شیگاتوکسین مربوط به دو فصل اول سال بود.
