بخشی از مقاله
چکیده
یکی از مهمترین بیماری های باکتریایی نوزادان زنبورعسل بیماری لوک آمریکایی است که همه ساله خسارات زیادی را به صنعت زنبورداری وارد می کند,با توجه به پوشش گیاهی مطلوب و میزان مهاجرت پذیری بالای این منطقه میزان آلودگی به این بیماری مورد بررسی قرار گرفت وتعداد 40 زنبورستان در2 شهرستان کرج و ساوجبلاغ بطور تصادفی انتخاب شدند و از هر زنبورستان 5 کندو و از هر کندو 5 نمونه لارو و شفیره,زنبور بالغ,موم,گرده و عسل جمع آوری شد و در مجموع 1000 نمونه اخذ ودر آزمایشگاه بررسی شد. پس از کشت نمونه ها و انجام آزمایشات تشخیصی تفریقی 3 زنبورستان از 40 زنبورستان مورد بررسی آلوده به باکتری پنی باسیلوس لاروا,عامل بیماری لوک آمریکایی تشخیص داده شدند که معادل %7/5 کل زنبورستانهای مورد مطالعه میباشد که تهدیدی جدی برای شیوع بیماری در منطقه محسوب میشود
مقدمه
یکی از مهمترین ومهلکترین بیماری های نوزادان زنبورعسل بیماری لوک آمریکایی است. عامل بیماری لوک آمریکایی باکتری پنی باسیلوس لاروا است که در سال 1906 توسط یک آمریکایی بنام وایت کشف شد - 3،8، - 14
علائم بیماری عبارتند از بوی زننده سریشمی که مشخصه مهم و اصلی بیماری لوک آمریکایی و وجه تمایز مهمی از سایر بیماریها است ولهیدگی لارو که با آزمون چوب کبریت آزمایش می شودوزبان شفیرگی و حالت موزاییکی و ناهمواری درپوش سلولهای نوزادان وتغییر رنگ سلولهای آلوده و تیره , چرب , فرورفته و سوراخ شدن درپوشها و ایجاد پوسته یا فلس
اپیدمیولوژی بیماری به نحوی است که بیماری تقریبا در تمام نقاط جهان حضور دارد و محدودیت خاصی برای شیوع بیماری لوک آمریکایی وجود ندارد و در هر فصل و زمانی امکان شیوع بیماری در صورت تخمریزی ملکه و حضور نوزادان در داخل کلنی وجود دارد
روشهای تشخیص بیماری و جداسازی باکتری پنی باسیلوس لاروا:
-1کشت باکتریایی نمونهها
-2 روشهای تشخیص بدون کشت
-1-2 آزمایش شیر -3-2 Pcr -2-2 روشهای ایمونولوژیک - ایمونو فلورسنس و الیزا - .
مواد و روش ها انتخاب منطقه نمونه گیری و شرایط منطقه:تحقیق حاضر در غرب استان تهران، شهرستانهای کرج و ساوجبلاغ انجام یافته است.تعداد زنبورستانهای منطقه مطابق لیست سرشماری سال ,1385 شهرستان کرج شامل 85 زنبورستان و ساوجبلاغ 35 الی 120 زنبورستان می باشد.
تعیین تعداد نمونه و روش نمونه گیری: در مجموع 40 زنبورستان جهت اخذ نمونه در این طرح در نظر گرفته شد که از هر زنبورستان بدون در نظر گرفتن تعداد کندوهای زنبورستان 5 کندو به صورت تصادفی جهت اخذ نمونه انتخاب شدند و از هر کندو 5 نمونه شامل نمونه های عسل، گرده، موم، لارو و شفیره، زنبور بالغ، جمع آوری شد .
نحوه نمونه برداری و روش اخذ نمونه:
عسل : با استفاده از تیغ اسکالپل تکه ای ازشان را که ترجیحاًحاوی سلولهای سربسته عسل است به ابعاد 5*4 سانتی متر جدا کرده و داخل ظرف استریل نمونه قرار می دهیم.
گرده : منطقه ای ازشان را که حاوی مقدار بیشتری گرده است را انتخاب و مانندنمونه عسل عمل میکنیم.
موم : تکه ای از موم که ترجیحاً کهنه باشدرا انتخاب و مانند نمونه عسل عمل میکنیم.
لارو و شفیره :قسمتی از شان که حاوی نوزادان سربسته و سرباز - لارو و شفیره - به طور یکنواخت می باشد را انتخاب کرده و نمونه گیری میشود.
زنبور بالغ : 30 الی 40 زنبور را در ظرف جمع آوری میکنیم.
آماده سازی نمونه ها:
برای آماده سازی نمونه ها ابتدا هر 5 نمونه مشابه اخذ شده از یک زنبورستان باهم ادغام شده و سپس سایر مراحل به روش زیر انجام میشود:
عسل : خارج کردن عسل از تکه شان حاوی عسل با پیپت پاستور و یا فشار دادن سلولهای حاوی عسل- صاف کردن عسل از ذرات خارجی و خرده های موم و گرده - رقیق سازی عسل به نسبت 1 به1 - 9 سی سی عسل در9 سی سی آب مقطر استریل - - سانتریفوژ با سرعت 1500 دور و به مدت 20 دقیقه - حذف محلول رویی تا جایی که حدود 1 سی سی از آن روی رسوب ته لوله ها باقی بماند .مخلوط کردن 1 سی سی باقیمانده با استفاده از شیکر و انتقال آن به ویالهای شیشه ای.
گرده :گرده با استفاده از قاشقکهای آزمایشگاهی و پنس از داخل سلولها خارج شده و به نسبت 1 به9 رقیق سازی 1 - سی سی عسل در9 سی سی آب مقطر استریل - شده وسایر مراحل مانند عسل انجام میشود لارو و شفیره : هموژنیزه نمودن حدود 20-30 عدد از آنها با 20-30 میلی لیتر آب مقطر استریل و سایر مراحل مانند عسل.
زنبورهای بالغ :مخلوط و هموژنیزاسیون20 عدد از آنها با 20 میلی لیتر آب مقطر استریل و سایر مراحل مانند عسل.
از بین بردن باکتریهای فاقد اسپور با حرارت مرطوب:
قرار دادن ویالهای شیشهای حاوی نمونههای آماده شده داخل بن ماری 80درجه به مدت 10 دقیقه یا 90 درجه به مدت 6دقیقه برای از بین بردن سایر باکتریهای فاقد اسپور.
کشت باکتریایی نمونهها:
آماده سازی محیط کشتMYPGP وانتقال0/5 میلیلیتر از محتویات ویالهای شیشهای به سطح پلیتها و پخش آن با سوآپ استریل وانتقال پلیتها به گرمخانه . - 1 - 35°c
تستهای تفریقی :
تستهای تفریقی انجام شده باکتری پنیباسیلوس لاروا از سایر باکتریها شامل 9 مورد هستند که به ترتیب اولویت ذکر میشوند:
تست قطره معلق اصلاح شده ,کاتالاز, رنگ آمیزی گرم, احیاء نیترات, مصرف ستیرات, تولید اسید ازقندها, آب کردن ژلاتین, تولید اندول, واکنشVp
نتایج و بحث
نتایج آزمایش کاتالاز: از 200 نمونه مورد بررسی در این مرحله 14 نمونه کاتالاز منفی بودند که با سایر آزمایشات مورد بررسی بیشتر قرار گرفتند و 186 نمونه دیگر که کاتالاز مثبت بودند در همین مرحله از آزمایشات حذف شدند.
نتایج آزمایش رنگ آمیزی گرم : از 14 مورد رنگ آمیزی شده 7 مورد با سیلوس گرم مثبت و7مورد گرم منفی مشاهده شد.
نتایج آزمایش آب کردن ژلاتین: در هر 7 مورد نتیجه آزمایش مثبت بود و ژلاتین داخل لوله های آزمایش ذوب شد.
نتایج آزمایش اندول و سیترات همگی منفی بودند.
نتایج آزمایش :VPاز 7 نمونه ای که تحت آزمایش VP قرار گرفتند 6 مورد VP منفی بودند و 1 مورد VP مثبت بود.
نتایج آزمایش تولید اسید از قند گلوکز: نتایج 6 نمونه ای که VP منفی بودنددر این مرحله 3 نمونه گلوکز مثبت و 3نمونه گلوکز منفی بود و نتیجه آزمایش مربوط به نمونه ای که VP مثبت بود گلوکز مثبت بدست آمد .
نتایج آزمایش تولید اسید از قند گزیلوز:از 6 نمونه VP منفی , 3 مورد گزیلوز منفی و 3 مورد گزیلوز مثبت بودند و نتیجه نمونه ای که VP مثبت بود گزیلوز مثبت بدست آمد.
نتایج آزمایش تولید اسید از قند مانیتول:
نتایج آزمایشات این مرحله 3 نمونه مانیتول مثبت و 3 نمونه مانیتول منفی بدست آمد و نتیجه نمونه VP مثبت هم منفی بود.
نتایج بدست آمده حاکی از آن است که 3 زنبورستان از 40 زنبورستان مورد مطالعه آلوده به باکتری پنی باسیلوس لاروا بودند و این مقدار آلودگی معادل % 7/5 کل زنبورستانها می باشد - نمودار - 1 ، با توجه به آنکه از هر زنبور ستان 25نمونه اخذ شده است و مطابق روش کار هر 5 نمونه مشابه با هم مخلوط و بصورت یکجا مورد کشت و آزمایش قرار گرفتند در مجموع از 200 نمونه مورد آزمایش نسبت آلودگی % 1/5 می باشد - نمودار . - 2 با توجه به موارد جداسازی باکتری پنی باسیلوس لاروا که در 2 مورد موم و 1 مورد لارو صورت گرفته است در موم نسبت به دویست نمونه اخذ شده %1 و در مورد لارو %0/5 می باشد
نمودار-1 میزان آلودگی در کل زنبورستانها
نمودار-2میزان آلودگی نسبت به دویست نمونه اخذ شده
نمودار -3نسبت موارد جداسازی شده موم و لارو به کل نمونه ها
آلوده غیر آلوده
اطلاعات مبین آن است که بیشترین موارد جداسازی شده در درجه اول مربوط به موم و سپس مربوط به لارو و شفیره می باشد که این نتیجه را می توان به ماندگاری طولانی مدت اسپورهای باکتری پنی باسیلوس لاروا در موم ارتباط داد که در منابع مختلف نیز به این مسئله اشاره شده است
