بخشی از مقاله

چکیده

توالیهای ریزماهواره - SSR - ، نشانگرهای مولکولی مهمی برای طیف گستردهای از برنامههای کاربردی مانند نقشه برداری ژنوم، شناسایی و تنوع ژنتیکی میباشند. با افزایش در دسترس بودن اطلاعات توالی ژنوم، امکان استفادهی بیشتر و بهتر از نشانگر SSR فراهم گردیده است. در این پژوهش ژنتیکی، جدایههای قارچ Paecilomyces formosus متعلق به دو استان با استفاده از نشانگر ریز ماهواره مورد بررسی قرار گرفت.

نمونه برداری به صورت تصادفی از 11 منطقه استان های یزد و خراسان رضوی انجام گرفت و در نهایت تعداد 50 جدایه برای مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گرفت. از الگوی توالی پیش فرض ژنوم Byssochlamys spectabilis No.5 برای تعیین توالی ریزماهوارهها با استفاده از نرم افزار Primer3 استفاده و در نهایت آغازگرها بر اساس نواحی کناری ریزماهوارهها طراحی شدند. از تعداد 20 آغازگر طراحی شده، تعداد 5 آغازگر با توانایی تکثیر قطعه مورد نظر انتخاب گردید.

مطالعه تنوع ژنتیکی جدایه ها با استفاده از نشانگر SSR، درجه بالایی از چند شکلی را در جدایههای مورد مطالعه نشان داد. تعیین تشابه جدایه با استفاده از ضریب شباهت جاکارد و روش الگوریتم UPGMA انجام شد. کل جدایهها طبق ضریب تشابه جاکارد - 86 درصد - در 6 گروه ژنوتیپی طبقه بندی شدند. نتایج نشان داد که آغازگر PVar15 نسبت به بقیه آغازگرها تنوع ژنی بالاتری داشته و از نظر تنوع ژنتیکی جدایههای منطقه سبزوار تفاوت معنی داری را نشان دادند.

-1 مقدمه

پسته ی ایرانی به دلیل طعم و کیفیت مطلوب در جهان بهترین است که همین امر موجب شده که بخش بزرگی از صادرات غیر نفتی ایران را به خود اختصاص دهد .[1] تولید این محصول در کشور در حال کاهش است که از عوامل تهدید کننده تولید پسته در ایران آفات و عوامل بیماری زا میباشند. بیماری سر خشکیدگی درختان پسته یکی از مهمترین بیماریهای این درخت است که در چند سال اخیر با پیشرفتی سریع باعث خشک شدن کامل درختان علاوه بر سر شاخهها شده است.

قارچ Paecilomyces formosus با فرم جنسی Byssochlamys sp. به عنوان عامل اصلی بیماری، اولین بار در استان کرمان مشاهده شد.[2] مطالعات گذشته که بر اساس ویژگیهای ریخت شناسی صورت گرفته بود تمامی جدایهها را در گونه مرکب  P. variotti قرار دادند با توجه به گسترش روزافزون این بیماری، کنترل آن از اهمیت بسزایی برخوردار است. استفاده از رقمهای مقاوم، به عنوان روش های کنترلی ایمن و سازگار با محیط زیست از اهمیت بالایی برخوردار است برای رسیدن به این مهم شناسایی جمعیت در سطح گونه و نژاد امری ضروری است.

مطالعات مولکولی روی بررسی تنوع ژنتیکی گونه P. fumosoroseus با نشانگر RFLP انجام شد که در نهایت سه گروه ریخت شناسی درون این گونه تشخیص داده شد .[3] در یک تحقیق که روی جداسازی و تشخیص لوکوسهای ریزماهواره - میکروستایلت - گونه P. fumosoroseus با نه نشانگر ریزماهواره انجام شد، 26 جدایه جدا شد که اختلاف این ها براساس محل جغرافی شان بود .[4] در یک بررسی مولکولی که در آن با استفاده از واکنشهای PCR، انگشتنگاری DNA برای گونههای P. fomosoroseus و P. lilacinus صورت گرفت، جدایهها بهدرستی به گونههای اختصاصیشان تقسیم شدند، اما ارتباط زیادی با دامنه میزبانی و منشأ جغرافیایی آنها یافت نشد .

[5] برای بررسی چند شکلی درون گونههای قارچ P. lilacinus با استفاده از مارکر RAPD نیز بین جدایهها از نظر ژنی تفاوت قابل ملاحظهای وجود داشت ولی از لحاظ منشأ جغرافیایی تنوعی بین جدایهها یافت نشد .[6] با بررسی 28 جدایه P. variotii در استان کرمان به کمک نشانگر PCR-RFLP، جدایه ها با سطح تشابه 70 درصد در نه گروه قرار گرفتند. نتایج این تحقیق نشان می دهد با توجه به اینکه جدایه های هر منطقه در دودمان کلونی همان منطقه قرار گرفتند، بین جدایههای هر منطقه رابطه اختصاصی وجود دارد ولی بین پراکنش و تنوع جدایه های قارچی و فواصل مناطق جغرافیایی مختلف استان کرمان هیچ رابطه ای مشاهده نشد.[7] هدف از این بررسی تعیین تنوع ژنتیکی جدایههای P. formosus به کمک نشانگر SSR بود.

-2 مواد و روش ها

-2-1 نمونه برداری و جداسازی طی سال های 91-93 به طور تصادفی از باغ های پسته استانهای یزد و خراسان رضوی نمونه برداری صورت گرفت، سپس با تهیه لام میکروسکوپی از هر جدایه، شناسایی دقیق هر کدام از جدایهها با استفاده از کلیدهای معتبر انجام گرفت.

-2-2 بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر 665

-2-2-1 استخراج 1$

استخراج DNA به روش CTAB انجام گرفت.DNAها در دمای -20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. تعیین کیفیت و کمیت DNA به کمک روشهای الکتروفورز - Bio-RAD, USA - ژل آگارز و دستگاه بیوفتومتر CICEL مدل 2021 صورت گرفت. -2-2-2 طراحی آغازگر  به منظور طراحی آغازگر ریزماهواره از توالی ژنوم Byssochlamys   spectabilis   No.5 از NCBI - www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BAUL00000000 - استفاده گردید. با استفاده از الگوی از پیش تعیین شده نرم افزار .[8] - http://bioinfo.ut.ee/primer3/ - Primer3 پس از تعیین توالی ریزماهواره ها، آغازگرها براساس نواحی کناری ریزماهواره ها طراحی شدند. در نهایت برای مطالعات تعیین تنوع ژنتیکی از مجموع 20 آغازگر طراحی شده، پنج آغازگر که تکثیر مناسب قطعات را داشتند. برای آزمایشات مورد استفاده قرار گرفتند.

-2-2-3 واکنش زنجیرهای پلیمراز

تکثیر قطعات 1$ با واکنش 3&5 در حجم 25 میکرولیتر - شامل 12/5 میکرولیتر PCR master - سینا ژن - ، 10 میکرولیترdH2O، یک میکرولیتر 20 - 1$ نانوگرم - و یک میکرولیتر آغازگر - در دستگاه ترموسایکلر مدل Eppendorf انجام گرفت. تعداد 35 سیکل حرارتی با دمای 95 درجه سانتیگراد - یک دقیقه - ، 48-55 درجه سانتیگراد - یک دقیقه - و 72درجه سانتی گراد - یک دقیقه - بهترتیب برای واسرشت شدن، اتصال و بسط DNA در نظر گرفته خواهد شد. محصول حاصل از واکنش PCR روی ژل آگاروز 2 درصد در دستگاه الکتروفورز - Bio-Rad, USA - با ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقیقه الکتروفورز می شود. سپس نقوش الکتروفورزی حاصل زیر نور UV مشاهده و نتایج به دست آمده توسط دستگاه ژل خوان1 - Bio-Rad, USA - عکسبرداری و ثبت میگردد.

-2-3 تجزیه و تحلیل دادهها

-2-3-1 تجزیه دادهها

به منظور تعیین تنوع ژنتیکی، از نرم افزار PopGene322 استفاده شد و باندهای قابل رؤیت روی ژل آگاروز بر اساس وجود - یک - یا عدم وجود - صفر - باند رتبه بندی شدند. تجزیه و تحلیل انجام شده با استفاده از نرم افزار PopGene32، با استفاده از نرم افزار GenAlEx 6.5b3 نیز انجام شد. آنالیز واریانس مولکولی نیز به کمک نرم افزارGenAlEx 6.5b3 انجام گرفت.

-2-3-2 تجزیه خوشهای

تجزیه و تحلیل خوشهای دادههای مربوط به انگشت نگاری DNA با استفاده از نرمافزار NTSYS pc version 2.10 انجام شد. تجزیه و تحلیل خوشهای دادهها با استفاده از الگوریتم Unweighted Pair Group Method - UPGMA - with Arthmattric Average و ضریب تشابه جاکارد صورت گرفت.

در متن اصلی مقاله به هم ریختگی وجود ندارد. برای مطالعه بیشتر مقاله آن را خریداری کنید