بخشی از مقاله
چکیده:
کلاژن به دلیل داشتن خواص منحصر به فرد و ساختار فیبری مناسب، به طور گسترده در زیست پزشکی مورد استفاده قرار می گیرد. به همین دلیل، انتخاب منبع مناسب، قابل اطمینان و ارزان قیمت برای استخراج کلاژن مورد توجه محققین قرار گرفته است. ضایعات ماهی به عنوان یک منبع پروتئینی حاوی درصد بالایی از کلاژن نوع اول است که می تواند به عنوان منبع مناسب برای استخراج کلاژن باشد. هدف از این پژوهش استخراج کلاژن از پوست ماهی با استفاده از روش اسیدی است. مشخصات فیزیکی و شیمیایی ساختار کلاژن با استفاده از انالیز جذب فرابنفش، طیف سنجی فوریه مادون قرمز و میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی شد. پیک 230nmدرطیف جذب فرابنفش، نشان می دهد که کلاژن بدست امده از خلوص بالایی برخوردار است. بررسی طیف سنجی فوریه مادون قرمز حضور گروه های عاملی N-H، C=O، 2 در ساختار کلاژن را تایید می کند در نتیجه ساختار مارپیچی سه گانه کلاژن در زمان استخراج حفظ شده است. همچنین با توجه به تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی، کلاژن بدست امده دارای ساختار فیبری مناسب برای کاربردهای زیست پزشکی می باشد.
واژه های کلیدی:کلاژن، ضایعات ماهی، مورفلوژی، زیست ماده
مقدمه
کلاژن اصلی ترین پروتئین تشکیل دهنده ساختار موجودات پرسلولی است. پروتئین کلاژن از اجزای اصلی ساختمان براین کلاژن دارای خواص منحصر به فردی از جمله زیست استخوانها، پوست، عضله ها، تاندون ها و رباط های بدن است. البته در رگ های خونی، قرنیه و دندان هم کلاژن یافت می شود [ 1]کلاژن درصد بالایی از ساختار موجودات پرسلولی را شامل برای درمان زخم، سوختگی، جراحی های زیبایی و می شود و بسته به نوع بافت مورد نظر می تواند ساختار متفاوتی داشته باشد[2]در حال حاضر 29 گونه متفاوت از کلاژن، با به دلیل داشتن گروه های های استخوانی و ایمپلنت دارد 8،7ماهیت امینواسیدی و ساختار مولکولی منحصر به فرد شناخته شده اند، در این بین کلاژن نوع اول بیشترین فراوانی را داشته و به طورگسترده در صنایع غذایی، محصولات ارایشی و بهداشتی ، زیست پزشکی و صنایع دارویی مورد استفاده قرار می گیرد4،3 علاوه تخریب پذیری، زیست سازگاری، غیر سمی بودن و انتی ژنی [ ] به همین دلیل کاربرد گسترده ای در پزشکی ضعیف می باشد.
5نیزدرمهندسی پزشکی برای ساخت چسب های دارویی 6،5 ، داربست عاملی مناسب به عنوان حامل دارویی مورد استفاده قرار می گیرد.[11-9]منابع متعددی برای استخراج کلاژن وجود دارد که رایج ترین آن ها منابع ناشی از گاو و خوک می باشد اما به دلیل خطر بروز بیماری هایی متعدد از جمله جنون گاوی و نیز غیر قابل مصرف بودن برخی از این منابع براساس برخی از ادیان - در دین اسلام و یهود استفاده از خوک حرام می باشد همچنین کلاژن بدست امده از منبع گاوی توسط هندو ها رد می شود - ، تلاش برای یافتن منابع جایگزین برای استخراج کلاژن افزایش یافته است. 12]،4،[3 سالانه حجم بسیار زیادی از ضایعات ماهی تولید می شود.
ضایعات ماهی به عنوان یک منبع غنی از پروتئین، به خصوص پروتئین کلاژن می باشد. ضایعات ماهی شامل پوست، پولک، استخوان و... است و پوست ماهی منبع غنی از کلاژن است. ضایعات ماهی به عنوان یک منبع ارزان قیمت می تواند منبع مناسبی برای استخراج کلاژن باشد .استخراج کلاژن از ضایعات ماهی علاوه بر کاهش هزینه های تولید به دلیل استفاده از محصولات فرعی صنایع غذایی دریایی و تولید زیست ماده ارزشمند می تواند ارزش افزوده بیشتری نیز به همراه داشته باشد. از سوی دیگر ضایعات ماهی به عنوان یک منبع پروتئینی در صورت ورود به محیط سبب بروز مشکلات زیست محیطی نیز می شود. [3]با توجه به فراوانی ضایعات ماهی در ناحیه شمال کشور، ارازن و در دست رس بودن آن استفاده از این منبع برای استخراج کلاژن دارای ارزش اقتصادی بوده و سبب جلوگیری از ورود منبع پروتئینی به محیط زیست می شود. پژوهش حاضر با هدف استخراج کلاژن از پوست ماهی سفید به عنوان نماینده ماهیان دریای کاسپین و نیز بررسی ساختار شیمیایی و مورفولوژی آن، انجام شده است .
بخش تجربی
مواد و روش ها
پوست ماهی سفید، اسید استیک%96، سدیم هیدروکسید، هیدروژن پر اکسید%37، آب دوبار تقطیر، دیالیز بگ - با مش 14000تا12000 دالتون -
جمع اوری و اماده سازی پوست ماهی
تعداد مشخصی ماهی سفید از بازار ماهی فروشان در انزلی تهیه و سپس با اب سرد شیر شسته شو داده شد. پس از جدا سازی پوست ماهی با استفاده از چاقو باقی مانده های گوشت چسپیده به پوست جدا سازی شدند. مرحله بعد با استفاده از قیچی پوست ماهی به قطعات ریز تری خرد شد و تا زمان مصرف در کیسه های پلی ایتلن در دمای -20 درجه نگه داری شد .
استخراج کلاژن محلول در اسید
استخراج کلاژن با استفاده از روش ذکر شده در منبع [13]با اندکی اصلاح در روش انجام شد. به منظور چربی زدایی، به مقدارگرم مشخصی از پوست ماهی به نسبت - w/v - 1:5 آب دوبار تقطیر اضافه شد پس از هم خوردن در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور rpm 5000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس جهت حذف پروتئین های غیر کلاژنی، پوست ماهی به مدت 48 ساعت در محلول سود 0/5 مولار به نسبت - w/v - 1:10 در دمای 4 درجه قرار داده می شود . هر 24 ساعت محلول تعویض شد . پس از این مرحله ، پوست ماهی با آب دوبار تقطیر تا رسیدن به pH خنثی شسته شو داده می شود .
جهت حذف سایر اجزای باقی مانده پوست ماهی ها با محلول هیدروژن پراکسید %3 مخلوط شده و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه نگه داری می شود سپس با اب مقطر تا رسیدن به pHخنثی شسته شو داده می شود. استخراج کلاژن توسط محلول 0,5 مولار اسید استیک انجام می شود. این مرحله به مدت 72 ساعت، در دمای 4 درجه سانتی گراد و همراه با همزدن پیوسته صورت می گیرد. محلول استخراج شده، به مدت 30 دقیقه با دور rpm5000 دردمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد و محلول رویی جدا شده و وارد دیالیز بگ می شود. عمل دیالیز در مجاورت اب دوبار تقطیر در دمای 6 درجه سانتی گراد انجام می شود . محلول دیالیز هر 24 ساعت تا رسیدن به pH، 6/5 تعویض می شود . پس تکمیل فرایند، نمونه ها فریز دررایینگ شده و کلاژن بدست امده در ظرف عاری از هوا در دمای 4 درجه سانتی گراد نگه داری می شود .
نتایج و بحث
انالیز طیف جذب UV
ساختار مارپیچی کلاژن دارای پیک جذب ماکزیمم در طول موج 230 nm است . از این رو بررسی طیف جذب UV در محدوده 230تا 400 nm اسان ترین راه تشخیص کلاژن می باشد
. بررسی عدد جذب uv کلاژن استخراج شده، mg2 از کلاژن استخراج شده را در ml4 اسید استیک mol/L0/5 حل می کنیم سپس در دمای 4 درجه سانتی گراد با دور rpm2000 سانتریفیوژ می کنیم . با استفاده از سل کوارتز در محدوده 210 تاnm 400 عدد جذب را بررسی می کنیم .پیک 220 nm ، پیک ماکزیمم جذب اسید استیک است که وابستگی شدیدی به تغییرات pH داشته و می تواند بین 200 تا220nm جابه جا شود. پیک 230nm، پیک جذب ماکزیمم کلاژن می باشد و ممکن است تحت تاثیر گروه های موجود در ساختار سه گانه کلاژن قرار گرفته و در بازه 220 تا 240 nm جا به جا شود. پیک جذب 280nm نیز به دلیل دلیل تریپتوفان،تیروزین و فنیل آلانین در کلاژن می باشد[3] طیف جذب فرابنفش بدست امده در این پژوهش به خوبی توسط پژوهش های گذشته توجیه می شود. می توان نتیجه گرفت که کلاژن بدست امده درجه خلوص بالایی دارد و پروتئین های غیر کلاژنی به خوبی از سیستم حذف شده اند .
طیف سنجی فوریه مادون قرمز
طیف جذب مادون قرمز کلاژن پوست ماهی در بازه 400 تا 4000 cm−1 بدست امد .طیف کلاژن دارای پنج پیک تشخیصیاصلی، Amid A، Amid B، Amid Ι ، Amid ΙΙ ، Amid ΙΙΙ میباشد - شکل . - 2 باند های Amid Ι، Amid ΙΙ ، Amid ΙΙΙ نشان دهنده الگوی قرار گیری مولکول ها درساختار سه بعدی کلاژن می باشد. مشخه پیک Amid Ι در بازه 1600 تا 1700cm−1 به دلیل ویبراسیون کششی C=O ایجاد می شود[3]که در شکل 1704/79بدست امده است. پیک Amid ΙΙ در بازه 1550 تا 1600 −1 به دلیل ویبراسیون خمشی N-H همراه با ویبراسیون کششی C-N قرار دارد4]،[3که مقدار آن در طیف 1550/32 است.
باند Amid ΙΙΙ در محدوده 1235 تا 1240cm−1 به دلیل کشش نامتقارن CH2 ایجاد می شود[14]مقدار این پیک 1234/24بدست امده است. پیک Amid A، باند کششی N-H و وجود پیوند هیدروژنی را نشان می دهد. ویبراسیون کششی N-H معمولا در بازه 3400 تا 3440cm−1 ظاهر می شود در مواردی پیک N-H تا 3300cm−1 می تواند کاهش پیدا کند. 12]،[3در این جا عدد 3394/16 برای این پیک بدست امده است. طیف بدست امده با داده های پژوهش های قبلی تناسب داشته و نشان می دهد ساختار سه گانه کلاژن به خوبی حفظ شده است.
