بخشی از مقاله
چکیده پژوهش
کلاژن داراي کاربردهاي زیادي در تهیه محصولات دارویی ، غذایی ، پزشکی ، بهداشتی و آرایشی می باشد. بومی کردن روش استخراج این پروتئین از خیار دریایی در داخل کشور با در نظر گرفتن برنامه توسعه اي کشور در بخش بیوتکنولوژي می تواند در آینده منجر به تولید انبوه آن و در نتیجه سود آوري تولید آن گردد. در این پژوهش روش جداسازي و آزمون هاي شناسایی کلاژن قابل انحلال در پپسین - - PSC استخراج شده از دیواره خیار دریاییHolothuria parva ارائه شده است.
آزمون هاي SDS-PAGE و FT-IR جهت اثبات حضور PSC در دیواره خیار دریایی مورد تحقیق مورد استفاده قرار گرفته است. آزمون SDS-PAGE کلاژن حل شده در پپسین - PSC - نشان داده است که PSC داراي یک جزء اصلی شامل زنجیره α1 با وزن ملکولی اندکی بیشتر از 130 kDa و یک جزء اندك شامل زنجیره هاي دوتایی β می باشد. در آنالیزFT-IR وجود باند پهن در ناحیه 3420 cm-1 نشان دهنده حضور پیوند آزاد N-H و حضور باند تیز در ناحیه1638 cm-1 نشان دهنده حضور پیوند C=O می باشد.
مقدمه
ترکیبات طبیعی موجود در جانداران دریایی را می توان بعنوان یک منبع غنی از ترکیباتی با کاربرد غذایی، عطریات ، رنگدانه ها ، دارویی و پزشکی استفاده نمود. ترکیبات داراي فعالیتهاي زیستی را از گروههاي مختلف جانوري از جمله خرچنگها ، مرجانها ، خارپوستان ، ماهیان و اسفنجها جداسازي نمود. کلاژن فراوانترین پروتئین در بافت جانوران می باشد. ملکول کلاژن از سه زنجیره پروتئینی تشکیل شده که به دور یکدیگر پیچیدهاند. مولکولهاي کلاژن به گونهاي ویژه کنار یکدیگر آرایش مییابند و یک ریز رشته را میسازند. تعداد زیادي از این ریز رشتهها به دور یکدیگر میپیچند تا یک رشته کلاژن ساخته شود. سه پلی پپتید مجزا به نام زنجیرههاي آلفا که تروپوکلاژن نامیده میشوند در ساختار کلاژن شرکت دارند.
کلاژن داراي کاربرد هاي فراوانی در زمینه داروسازي و پزشکی، تهیه محصولات بهداشتی و آرایشی و صنایع غذایی می باشد. در سال هاي اخیر توجه زیادي به جداسازي کلاژن از موجودات دریایی شده است که علت آن عدم محدودیت استفاده از آن در رژیم غذایی و عدم ایجاد خطر ابتلا به بیماري هاي مسري می باشد. از کلاژن استخراج شده از منابع غیر دریایی خطر ابتلا به بیماري هاي 1TSE و 2BSE گزارش شده است - . - 1
در تحقیقاتی که اخراًی روي عصاره ها و ترکیبات به دست آمده از خیار دریایی صورت گرفته است خواص سیتوتوکسیسیتی ، آنتی اکسیدانی ، ضد باکتریایی، ضد التهابی، ضد ویروسی، ضد توموري و ضد سرطانی آن به اثبات رسیده است. تأثیر ضد باکتریایی عصاره هاي به دست آمده از قسمتهاي مختلف بدن و تخم هاي خیاردریایی در پژوهش هاي بسیاري به اثبات رسیده است - . - 7-2 در ایران نیز تحقیقات انجام شده بر روي خیار دریایی در دو بخش شناسایی گونه هاي موجود در خلیج فارس و دریاي عمان و خواص ضد باکتریایی آن متمرکز شده است ولیکن در مورد استخراج سایر ترکیبات طبیعی قابل استخراج نظیر کلاژن تحقیقاتی انجام نشده است.
مواد و روشها
در ابتدا تعداد 2 عدد خیار دریایی زنده Holothuria parva با میانگین وزن 100 گرم از سواحل دریاي عمان به منظور جداسازي کلاژن جمع آوري می شود. کلیه آزمایشات در این پروژه 3 بار تکرار شده است. در این تحقیق با استفاده از دستگاه هاي FT-IR ، Gel Electrophoresis ، کلاژن قابل حل در پپسین Pepsin Solubilized Collagen استخراج شده شناسایی می شود. مراحل جداسازي و شناسایی کلاژن از دیواره خیار دریاییHolothuria parva به شرح زیر است. تمامی مراحل در دماي 4 درجه سانتی گراد انجام شد - . - 1
مرحله اول : جداسازي و خالص سازي کلاژن محلول در پپسین
ابتدا پوست و بافت پیوندي خیار دریایی Holothuria parva با کمک قیچی به قطعات کوچک تقسیم گردید . تکه هاي خیار دریایی با 2 لیتر آب مقطر با کمک استیرر به مدت نیم ساعت در اتاق 4 درجه سانتی گراد شسته شد. مرحله شستشو با 2 بار تکرار انجام شده و سپس نمونه ها به منظور گسسته شدن ساختار بهم پیوسته کلاژن وارد محلول 1000 میلی لیتري4 EDTA میلی مولار و 0/1 Tris-HClمولار - pH=8 - شد و به مدت یک شبانه روز استیرر گردید - . - 1 در نتیجه مجموعه بهم پیوسته فیبرهاي کلاژن خیار دریایی بطور کامل به فرم فیبرهاي کلاژن از هم گسسته و بصورت یک مخلوط با ویسکوزیته بالا در می آید.
در ادامه مخلوط حاصله را به مدت نیم ساعت توسط سانتریفیوژ 9000g در دماي 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کرده رسوب را با یک لیتر آب مقطر مخلوط و استیرر کرده و دوباره سانتریفیوژ می کنیم این کار با 2 بار تکرار انجام شد تا به طور کامل شسته شود. رسوب نهایی با یک لیتر آب مقطر به مدت 24 ساعت استیرر شده و در مرحله بعد مخلوط حاصله را از یک پارچه تنظیف به منظور جداسازي ذرات نامحلول عبور داده و نمونه فیلتر شده به مدت 30 دقیقه توسط سانتریفیوژ 9000 g ، سانتریفیوژ گردید. رسوب حاصله با100 میلی لیتر 0/1 NaOH مولار به مدت 3 شبانه روز در دماي 4 درجه استیرر شد.
در ادامه مخلوط حاصله را به مدت نیم ساعت توسط سانتریفیوژ 9000g در دماي 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ کرده و شناور را دور ریخته و رسوب را با آب مقطر مخلوط کرده و استیرر می کنیم - - pH= 9 کار شستشو آنقدر ادامه داده شد تا pH مخلوط به 7 برسد. بعد از آخرین سانتریفیوژ رسوب را با 100 میلی لیتر از استیک اسید 0/5مولار و 0/5% - w/w - پپسین مخلوط کرده و به مدت 48 ساعت در دماي 4 درجه سانتی گراد استیرر شد. در مرحله بعد محلول را توسط سانتریفیوژ 12000g به مدت 1 ساعت سانتریفیوژ گردید و شناور جمع آوري شد.
رسوب را دوباره با 100 میلی لیتر از استیک اسید 0/5مولار و 0/5% - w/w - پپسین مخلوط کرده و مراحل بالا تکرار شد تا باقی مانده کلاژن استخراج شود - . - 1 به شناور محلول 0/8 NaCl مولار اضافه کرده و به مدت 48 ساعت در دماي 4 درجه سانتی گراد گذاشته شد تا پروتئین ها رسوب کنند. بعد از یک دور سانتریفیوژ 9000g در دماي 4 درجه سانتی گراد رسوب را در استیک اسید 0/5 مولار حل کرده و سپس در یک لیتر بافر 0/02 - pH=8 - Na2 HPO4 مولار و 50 میلی لیتر استیک اسید 0/1 مولار به مدت 24 ساعت به منظور غیر فعال کردن پپسین دیالیز کرده و با کمک دستگاه Freez dryer پودر گردید و اندکی از آن بصورت مایع نگهداري شد - . - 1
مرحله دوم : انجام آزمون SDS-PAGE
براي انجام این آزمون از ژل پلی آکریل آمید %30/8 استفاده شد. در این مرحله از ژل پایین %12/5 و از ژل بالاي %4 استفاده شد. پودر پروتئین در بافر نمونه و آب مقطر حل شده و به مدت 5 دقیقه در آب جوش گذاشته شد و به مایع آن نیز بافر نمونه اضافه شد و سپس هر دو روي ژل منتقل گردیدند ونهایتاًالکتروفورز با ولتاژ 120 به مدت 4 ساعت انجام شد. بعد از الکتروفورز، ژل باکوماسی آبی به مدت 20 دقیقه رنگ آمیزي گردید. سپس با محلول رنگ بر شامل متانول ، استیک اسید گلاسیال و آب مقطر رنگ بري صورت پذیرفت . - 1 -
