بخشی از مقاله
چکیده
بیماری شانکر باکتریایی یکی از مهمترین بیماریهای درختان میوه هستهدار میباشد که سبب ایجاد زخم های فرورفته تیره رنگ همراه با تراوش صمغ بر روی شاخهها میشود. بر اثر شانکر ارتباط قسمت بالای گیاه با بخش-های پایینتر قطع شده، برگها پیچیده، آویزان، سبز روشن و سپس زرد میشوند. به منظور بررسی شناسایی میکروارگانیسمهای دخیل در شانکر درختان میوه هستهدار نمونه برداری از باغات شمال فارس در بهار 1394 انجام گردید. ساقههای آلوده با آب شسته شد. قطعات دارای علایم پوست ساقه در آب مقطر استریل در ظرف پتری با تیغ خرد گردید. پس از 20 دقیقه نگهداری در دمای اتاق، چند لوپ از سوسپانسیون بدست آمده در سطح محیط آگار غذایی حاوی دو درصد سوکروز مخطط گردید.
بعد از چند روز تک کلنیهای شیری تا سفید که به صورت لایهای نازک بودند رشد کردند. از کلنیها سوسپانسیونی تهیه و به زیر پوست درختان مورد نظر تزریق گردید و بعد از حدود 10-7 روز علایم ظاهر شد . جدایههای مایهزنی شده به ساقهها دوباره از شانکرهای ایجاد شده جدا گردید. با استفاده از آغازگر rpoB حدود 1000bpاز پلیمراز تکثیر و توالییابی شد. توالیهای بدست آمده با استفاده از نرمافزار بلاست در ژن بانک با توالیهای موجود در این پایگاه مقایسه و میزان شباهت آنها تعیین گردید. با مقایسه توالی rpoB در ژن بانک جدایههای مورد نظر بیشترین شباهت را به Staphylococcus داشتهاند. جدایهها کند رشد و کلنی آنها به صورت ورقهای و نازک شیری تا زرد رنگ بود. جدایهها اکسیداز منفی و کاتالاز مثبت هستند، نمک 10 و 12 و 15 راتحمل کردند.
واژگان کلیدی : شانکر ، بیماریزایی ، rpoB
-1مقدمه
درختان میوه هسته دار که اغلب بومی مناطق معتدله هستند متعلق به خانواده گل سرخیان، زیر خانواده بادامیان و جنس آلو میباشند. گونه های مختلف این جنس به صورت درختان یا درختچه های خزان کننده یا همیشه سبز، با جوانه های زمستانه و فلسهای روی هم خوابیده زیاد، برگ های متناوب، اره ای و به ندرت با کناره های صاف و با گوشوارک هستند. گلها منفرد، گروهی یا خوشه ای، تعداد کاسبرگ ها و گلبرگ ها هر کدام 5 عدد، معمولا سفید برخی اوقات صورتی یا قرمز با پرچمهای فراوان، یک مادگی با خامه طویل، 3 تخمک، میوه شفت و معمولا با یک دانه هستند. کروموزوم پایه در این جنس 8 می باشد. این جنس بزرگ شامل هلو ،آلو، گیلاس ، زردآلو ، بادام و گونههایی با میوههای خوراکی و برخی به عنوان پایه یا به صورت زینتی کشت میشوند. . - 1 -
شانکر باکتریایی درختان هستهدار - Pseudomonas syringae pv. syringa، لکه برگی درختان هستهدار - Xanthomonas - arboricola pv. pruni، زنگ درختان میوه هستهدار - - Tranzchelia pruni-spinosa از مهمترین انواع بیماریئ های باکترایی درختان هستند. در ایران شانکر یاکتریایی ناشی از Pseudomonas syringae pv. syringae ابتدا از اصفهان سپس از مازندران، گلستان و خراسان گزارش گردید .در ادامه بررسی عوامل شانکر درختان هستهدار در استان مازندران و گیلان Xanthomonas. arboricola pv. pruni جداسازی شد. این بررسی بیان کننده دخالت Xanthomonas علاوه بر Pseudomonas syringae pv. syringae است.. در سال S.warneri 1395 را یکی از عوامل شانکر باکتریایی اعلام کردند. هدف از این بررسی شناسایی میکروارگانیسمهای دخیل در شانکر درختان میوه هستهدار از باغات شمال فارس می باشد.
-2مواد و روشها
نمونه برداری از درختان مشکوک به بیماری انجام شد و با قرار دادن نمونهها در پاکت کاغذی به آزمایشگاه جهت جداسازی عوامل بیماری منتقل گردید. ساقه آلوده با آب شستشو داده شد و قطعه حاوی علایم درون ظرف پتری استریل قرار داده و سپس همراه با مقداری آب به قطعات کوچکتر خرد شدند، پس از 30 دقیقه با لوپ مقداری از این سوسپانسیون روی محیط کشت NAS - نوتریونت آگار سوکروز - کشیده شد. پس از نگهداری پتریهای کشت شده در دمای 25 درجه سلسیوس، تک کلنیهای رشد کرده دوباره روی محیط کشت مذکور مخطط شده و یکی از تککلنیهای غالب از کشت هر نمونه در حال رشد انتخاب و روی محیط NAS تکثیر گردید. آزمون تحمل نمک 12 و 15 درصد، آزمونهای اکسیداز، کاتالاز صورت گرفت. برای استخراج DNA بافر CTAB نیم ساعت در حمام بنماری در 65 درجه قرارداده شد تا ذوب شود.
در مرحله بعد 600-650 میکرولیتر بافر CTAB را به درون ویال ریختیم و یک لوب مخمر اضافه کردیم وسپس ورتکس نموده وبعد به آن یک میکرولیتر مرکاپتواتانول اضافه کرده و دوباره ورتکس کردیم . ویالها را نیم ساعت در 65 درجه قرار دادیم و هر ده دقیقه آن را تکان داده. 600 میکرولیتر ایزوآمیلالکل-کلروفرم به آن اضافه ومقدارکمی ورتکس و به مدت 10 دقیقه در 12 هزار دور سانتریفیوژ کردیم سپس فاز رویی را به ویال جدید منتقل کردیم هم حجم فاز رویی ایزوپروپانول خنک اضافه کردیم سپس ویالها را به مدت یک ساعت در -20گذاشتیم. بعد از 1 ساعت ویالها را از فریزر برداشته و در 13هزار دور به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ سپس تمام محتویات را خالی و 1000میکرولیتر الکل 70 درصد خنک اضافه نموده و دوباره در 13 هزار دور 5 دقیقه سانتریفیوژکردیم. محتویات را خالی کرده و ویالها را به حالت برعکس قرار دادیم تا کاملا خشک شود بعداز آن 70 میکرولیتر TE اضافه کردیم. - . - 8
برای تخمین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از روش الکتروفورز ژل آگارز در بافرTBE استفاده شد برای هر نمونه، 4 میکرولیتر DNA استخراج شده با2 میکدرولیتر بافر یا رنگ بارگذاری مخلوط گردید و در چاهک ژل آگارز 0/8 درصد ریخته شد. ژل به مدت 1/5 ساعت و با ولتاژ ثابت 80 ولت، الکتروفورز شده و پس از رنگآمیزی با اتیدیومبروماید، DNA در زیر نور ماورا بنفش در دستگاه ژل داکیومنت مشاهده و عکس-برداری شد. وجود یک باند با وزن مولکولی بالا و بدن کشیدگی در طول ژل به عنوان معیار مناسب بودن کیفیت DNA تلقی گردید - . - 3 مواد مورد نیاز برای واکنش به جز DNA نمونه مطابق جدول ذیل تهیه گردید. هر واکنش در حجم 25 میکرولیتر انجام شد.
ژل آگارز 1.5 درصد در TBE تهیه و 4 میکرولیتر از محصول PCR با 2 میکرولیتر رنگ بارگذاری مخلوط گردید و هر نمونه در چاهک جداگانه ریخته شد. در چاهک انتهایی 2 میکرولیتر از نشانگر DNA ریخته شد. نمونهها به مدت 1/5 ساعت در ولتاژ ثابت 80 ولت الکتروفورز شدند. سپس ژل به مدت 15 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده شد. بعد از شستشو با آب مقطر، ژل در دستگاه ژل داکیومنت بهوسیله نور ماورابنفش مشاهده و از آن عکسبرداری شد. بس از تکثیر قطعه مورد نظر، قطعهها با ارسال به شرکت ماکروژن کره توالی یابی شدند و با استفاده از نرمافزار BioEdit ver . 7.0.9.0 توالیها اصلاح شده و با استفاده از نرمافزار بلاست موجود در ژن بانک NCBI همسانی توالیها با توالیهای موجود در ژن بانک مقایسه شدند
-3نتایج و بحث
نمونه ها از باغات شمال فارس جمع آوری گردید و نمونههایی که علایم شانکر را داشتند کشت گردید. بعد از نمونه برداری، نمونه-ها روی محیط NAS کشت داده شد و کلنیهای مورد نظر خالص سازی شدند. بعد از جداسازی کلنیها بر اساس آزمون گرم به دو گروه گرم مثبت و گرم منفی تقسیم شدند که در گروه گرم مثبت13 باکتری که باکتری هایی که رشد کم داشتند و رنگ کلنی به صورت شیری تا زرد بود مورد آزمایشهای شیمیایی قرار گرفتند که در نتیجه آن گروهی که اکسیداز منفی و کاتالاز مثبت داشتند و تحمل نمک 10 و 12و 15 درصد برای آنها مثبت بود مورد توجه قرار گرفتند. استخراج DNA شدند با ژن m13 گروهبندی شدند. سپس با ژنrpoB تکثیر شدند و باندهای اختصاصی آن در 1000 تا 1100 قابل رویت است. باندهای اختصاصی ژن در تصویر زیر قابل مشاهده است
