بخشی از مقاله
چکیده
باکتری Frankia اکتینومیستی رشتهای و عامل گره ریشهی توسکا و تثبیتکنندهی نیتروژن میباشد. برای جداسازی این باکتری، گره های ریشهی توسکای ییلاقی - Alnus subcordata - از حاشیهی دریاچهی الندان در کیاسر, استان مازندران جمعآوری شد. گرهها با آب مقطر استریل شسته و ضدعفونی شد و در محیط مایع DPM کشت داده شد. پس از 7 -15 روز ریسههای سفید رنگ باکتری در انتهای لولههای آزمایش مشاهده و در تشتکهای کشت حاوی محیط اصلاحشدهی DPM agar کشت داده شد. تعداد 18 جدایه از نمونههای جمعآوری شده بهدست آمد. بررسی با میکروسکوپ تشریح و میکرو سکوپ نوری انجام شد.
پس از 6-25 روز پرگنههای باکتری در محیط جامد به شکلهای مختلف شبیه به ستارهی دریایی با میانگین قطر 444,88 میکرومتر مشاهده شد. بررسیهای میکروسکوپی نشان داد که جدایه ها هیف های منشعب داشته و تشکیل وزیکول و اسپورانژیوم میدهند. بر اساس ویژگیهای خاص ریختشناسی, جدایهها متعلق به جنس Frankia تشخیص داده شدند.جدایهها در شکل و اندازهی پرگنه, هیف و اسپورانژیوم متفاوت بودند.لذا ممکن است در یک مکان بیش از یک نوع باکتری Frankia وجود داشته باشد.جداسازی و شناسایی باکتری Frankia برای اولین بار در ایران گزارش میشود.
کلمات کلیدی: Frankia، اکتینومیست، تثبیت نیتروژن، گره ریشه، توسکا ییلاقی ، Alnus subcordata
مقدمه
جنس Frankia متعلق به اکتینومیست ها بوده [12] و یک باکتری گرم مثبت رشتهای است.[10] این باکتری دارای هیفهای روی شی ا ست که ا سپورهای غیر متحرک بیرنگ تا سیاه رنگ دارد و در حالت همزی ستی موثر , اج سام وزیکول مانندی تولید میکند که برای انجام فعالیت نیتروژناز لازم است .[4] گونههای این جنس مزوفیلیک , هوازی یا در برخی موارد میکروآیروفیل , شیمیوارگانوتروف و کاتالاز مثبت هستند. پرگنههای باکتری در محیط جامد در مرکز متراکمتر از اطراف میباشد و قسمتهای قدیمیتر مانند اسپورانژیومها در مرکز فراوانترند .[11] پرگنهها نخی و فرورفته در آگار هستند و دارای قطر کمتر از 5 میلیمتر میباشند .[9]
باکتری فرانکیا قادر است در همزیستی با بیش از 200 گونه گیاهی متعلق به 24 جنس و 8 خانواده تشکیل غده دهد [5] .که اصطلاحا گیاهان اکتینوریزال نامیده می شوند .[17] گیاهانی که درگیر این همزیستی هستند از گونههای پیشگام و مهم در خاکهایی که کمبود نیتروژن دارند، میباشند.[15] از آنجایی که این گیاهان اغلب در خاکهای حا شیهای ر شد میکنند , کاربرد بالقوهای در ا صلاح و تهویهی خاک , تولید چوب و خمیر کاغذ , ایفای نقش به عنوان گیاه پرستار , زینتی , بادشکن و سوخت دارند .[7]از سال 1978 تعدادی جدایه ی Frankia از گره های ری شه ی گونه های مختلف تو سکا شنا سایی شده ا ست .[6]
این گونهها شامل Alnus glutinosa از اروپا، A. incana ssp. rugosa از آمریکا و A. incana از فنلاند میباشند .[11] شناختهترین همزی ستی فرانکیا با درختان تو سکا میبا شد که غدههای تیپ-آلنوس ت شکیل میدهد. این نوع غده ب صورت مرجانی شکل با ان شعابات دو شاخهای میبا شد .[2] این برج ستگیهای صورتی رنگ محل تجمع و ات صال فرانکیا به ری شه است . [1]بر اساس تعدادی از خصوصیات ریختشناسی میتوان جدایههای این جنس را شناسایی کرد .[12] در بررسی حاضر استرین هایی از Frankia از گرههای ریشه ی توسکا ییلاقی - - A.subcordata در شمال ایران جدا و جزئیاتی از ریختشناسی آن تعیین گردید.
مواد و روش
گرههای اکتینوریزال از ریشهی A.subcordata از حاشیهی دریاچهی الندان در هفتاد کیلومتری جادهی ساریBسمنان در استان مازندران، در تابستان 1393 جمع آوری شد و به آزمایشگاه باکتریشناسی منتقل شد.گره ها با آب مقطر استریل شسته و قبل از کشت، چند روز در دمای 4 درجه سلسیوس قرار داده شد و پس از آن برای نگهداری به دمای -20 درجهی سلسیوس منتقل شدند .[13] لوب های جداگانه ی گره یک دقیقه در هیپوکلریت سدیم - 3:10 - و یک دقیقه در هیدروژن پراکسید %30 ضدعفونی سطحی و چند مرتبه با آب مقطر استریل شسته شد . پوسته ی بیرونی لوبها جدا شده و لوبها به قسمت های کوچک تقسیم و به لولههای آزمایش حاوی محیط تعریف شده ی پروپیونات - - DPM منتقل شد .لوله های کشت شده به مدت 1 تا 4 هفته در دمای 28-30 درجهی سلسیوس نگهداری شدند.[18]
رشتههای رشد یافتهی باکتری در لوله آزمایش با عبور با فشار از سرنگ پنج میلیلیتری قطعه قطعه گردید. یک میلیلیتر از سوسپانسیون حاصل در تشتکهای کشت به روش [3] pure plate در محیط اصلاح شده ی DPM agar کشت داده شد. تشتکها کمی تکان داده شده و پس از جامد شدن به گرمخانه با دمای 28-30 درجهی سلسیوس منتقل گردید. تشتکها بطور روزانه تا زمان تشکیل پرگنه با میکروسکوپ تشریح بررسی شدند.اسلایدهای میکروسکوپی از ریسهها و پرگنههای باکتری در لاکتوفنل تهیه و با میکروسکوپ فاز کنتراست Nikon - مدل - E600 مورد بررسی قرارگرفته و با دوربین Nikon - D×M 1200 - از آنها عکسبرداری شد.
نتایج و بحث
ریسههای باکتری پس از گذشت 7-15 روز از زمان کشت نمونهها در محیط مایع DPM در لولههای آزمایش مشاهده شد. ریسهها سفید رنگ بوده و در انتهای لوله قرار داشتند. از نمونههای جمعآوری شده هجده جدایه بهدست آمد.پرگنههای باکتری در تشتکهای کشت حاوی محیط جامد DPM agar پس از 6-25 روز با میکروسکوپ تشریح قابل مشاهده بود. پرگنههای باکتری نخی،فرو رفته در آگار و شبیه به ستارهی دریایی بود - شکل . - 2مشاهدات میکروسکوپی نشان داد که هیفها در اطراف کلنی رشد شعاعی دارند. با توجه به شکل هیف جدایهها به دو گروه تقسیم شدند.
گروه اول - شکل - 3 با هیفهای صاف با انشعابات کم و کمی موجی شکل شامل جدایههای ok1, ok3, ok4, ok5, ok6, ok7,ok8, ok9, ok10, ok11, ok13, ok14, ok15, ok18 و گروه دوم - شکل - 4 با هیفهای بسیار موجی و منشعب شامل جدایههای ok2, ok12, ok16, ok17 بودند . جدایههای گروه اول فراوانتر بوده و تقریبا 78 درصد از کل جدایهها را شامل شدند. هر دو گروه اسپورانژیوم و وزیکول تولید کردند. از آنجا که اسپورانژیومها در مرکز پرگنه بیشتر دیده میشد فرض شد که رشد و شکلگیری پرگنه از مرکز آن شروع میگردد. اسپورانژیومها در اندازه و شکل بسیار متفاوت بودند و وزیکولها با یک انشعاب کوتاه از هیف اصلی قرار داشتند - شکل . - 5
