بخشی از مقاله
چکیده
شانکر و انگومک باکتریایی، عمدتا به درختان میوه هستهدار صدمه میزنند و در اکثر مناطق زیر کشت درختان میوه هستهدار وجود دارند. مشخصترین نشانههای بیماری، ایجاد شانکر همراه با تراوش انگومک است. به منظور بررسی شناسایی میکروارگانیسمهای دخیل در شانکر درختان میوه هستهدار نمونه برداری از باغات شمال فارس در بهار 1394 انجام گردید. ساقههای آلوده با آب شسته شد. قطعاتی از پوست ساقه دارای علایم در آب مقطر استریل در ظرف پتری با تیغ خرد گردید. پس از 20 دقیقه نگهداری در دمای اتاق، چند لوپ از سوسپانسیون بدست آمده در سطح محیط آگار غذایی حاوی دو درصد سوکروز مخطط گردیدبعد از چند روز نگه داری در دمای اتاق کلنی-های سفید مخمر مانند در سطح محیط رشد کردند.سوسپانسیون از کلونیها تهیه و به زیر پوست ساقه تزریق گردید بعد از 7 تا 10 روز علایم بیماری ظاهر شد. جدایههای مایه زنی شده دوباره از ساقههای الوده جداسازی گردید.شناسایی مولکولی با تکثیر بخشی از ژن D1/D2 انجام و قطعه توالییابی شده توالیهای بدست آمده با استفاده از نرم افزار بلاست در ژن بانک با تولیهای موجود در این پایگاه مقایسه و میزان شباهت تعیین گردید. توالی مورد نظر با PCR حدود 600 bp تکثیر شد. با مقایسه در ژن بانک جدایه مورد نظر بیشترین شباهت را به Cryptococcus adeliensis نشان دادند. جدایهها دارای کلونیهای کرم تا صورتی کمرنگ و سلولهای کروی می-باشد. جدایهها دارای کاتالاز مثبت، اورهآز مثبت، اکسیداز منفی، قادر به هیدرولیز ژلاتین ، اسکولین و آربوتین مثبت ولی منفی در ذوب زلاتین بودند.
واژگان کلیدی:شانکر، مخمر، D1/D2
-1مقدمه
درختان میوه هسته دار که اغلب بومی مناطق معتدله هستند متعلق به خانواده گل سرخیان، زیر خانواده بادامیان و جنس آلو میباشند. گونه های مختلف این جنس به صورت درختان یا درختچه های خزان کننده یا همیشه سبز، با جوانه های زمستانه و فلس¬های روی هم خوابیده زیاد، برگ های متناوب، اره ای و به ندرت با کناره های صاف و با گوشوارک هستند. گلها منفرد، گروهی یا خوشه ای، تعداد کاسبرگ ها و گلبرگ ها هر کدام 5 عدد، معمولا سفید برخی اوقات صورتی یا قرمز با پرچم های فراوان، یک مادگی با خامه طویل، 3 تخمک، میوه شفت و معمولا با یک دانه هستند. کروموزوم پایه در این جنس 8 می باشد. این جنس بزرگ شامل هلو ،آلو،گیلاس ، زردآلو ، بادام و گونه¬هایی با میوه¬های خوراکی و برخی به عنوان پایه یا به صورت زینتی کشت میشوند. . - 1 -
پیچیدگی برگ هلو و انبونک آلو - - Taphrina deformans,T. pruni ، غربالی درختان میوه هستهدار - Wilsonomyces carpophilus - ، گال طوقه درختان میوه هستهدار - - Agrobacterium tumefaciens، شانکر باکتریایی درختان میوه هستهدا - ر - Pseudomonas syringae pv. Syringa از بیماریهای مهم درختان است. اخیرا در ایران شانکر درختان میوه هستهدار ناشی از گونههای Cryptococcus از استانهای خراسان رضوی و شمالی و همچنین برخی از استانهای مرکزی ایرانگزارش شده است. گونههای جنس Cryptococcus دارای سلولهای گرد، بیضوی یا کشیده هستند. در اکثر گونهها کپسول پلیساکاریدی وجود دارد. تولید مثل آنها بوسیله جوانهزنی است و در برخی گونهها هیفهای کاذب یا حقیقی ممکن است دیده شود. رنگ کلنیها روی محیط کشت جامد ممکن است سفید، کرم یا مایل به قهوهای باشد و برخی از گونهها رنگدانههای قرمز، نارنجی، زرد یا قهوهای تیره تولید میکنند - . - 6 در مجموع هدف از این بررسی شناسایی میکروارگانیسمهای دخیل در شانکر درختان میوه هستهدار نمونه برداری از باغات شمال فارس بود.
-2مواد و روشها
نمونه برداری از درختان مشکوک به بیماری انجام شد و با قرار دادن نمونههای دارای شانکردر پاکت کاغذی به آزمایشگاه جهت جداسازی عوامل بیماری منتقل گردید.:ساقه آلوده با آب شستشو داده شد و قطعه حاوی علایم درون ظرف پتری استریل قرار داده سپس همراه با مقداری آب به قطعات کوچکتر خرد شدند، پس از 30 دقیقه با لوپ مقداری از این سوسپانسیون روی محیط کشت NAS - نوترینت آگار سوکروز - کشیده شد. پس از نگهداری پتریهای کشت شده در دمای 25 درجه سلسیوس، تک کلنی-های رشد کرده دوباره روی محیط کشت مذکور مخطط شده و یکی از تککلنیهای غالب از کشت هر نمونه در حال رشد انتخاب روی محیط NAS کشت و تکثیر گردید. برای استخراج DNAیک لوب از کشت 24 ساعته جدایهها در داخل لولههای اپندرف حاوی مقداری پودر شیشه و یک میلیلیتر بافر استخراج DNA - شامل تریس هیدروکلرید 0/01 مولار، 0/001 EDTA مولار و دو درصد تریتون - X100 ریخته و کاملا ورتکس شد.
سپس 200 میکرولیتر 10 SDS درصد به آنها اضافه شده و لولهها به مدت 30 ثانیه در ازت مایع قرار داده و سپس به آب با دمای نزدیک به جوش منتقل شدند. مرحله ذوب و انجماد سه بار تکرار میگردند. به لولهها به میزان هم حجم محلول کلروفرم اضافه و با احتیاط مقداری ورتکس میگردند. لولهها در 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. لایه رویی به لوله جدید منتقل و به هر لوله یک دهم حجم استات سدیم 3مولار - - 5-6 pH و 2 تا 2/5 برابر حجم اتانول 98 درصد با دمای -20 اضافه و لولهها چند بار سر و ته شدند. پس از قرار گرفتن لولهها در -20 درجه سلسیوس به مدت 2 ساعت لولهها در 12000 دور در دقیقه به مدت ده دقیقه سانتریفیوژگردید. فاز رویی دور ریخته شده و لولهها با درب باز به صورت مورب روی میز قرار داده تا رسوب خشک شود. سپس یک دهم حجم سوسپانسیون اولیه آب مقطر یا TE رقیق به لولهها اضافه میشود.
لولهها به مدت 4 ساعت در یخچال نگهداری و سپس به فریزر - -20 درجه سلسیوس - منتقل شدند. کیفیت و کمیت PCR در ژل آگارز 0/8 درصد در بافر TBE یا TAE با ولتاژ 75 ولت تعیین شد. پس از تکثیر قطعه مورد نظر، قطعهها با ارسال به شرکت ماکروژن کره توالی یابی شدند. با استفاده از نرمافزار BioEdit ver . 7.0.9.0 توالیها اصلاح شده و با استفاده از نرمافزار بلاست موجود در ژن بانک NCBI همسانی توالیها با توالیهای موجود در ژن بانک مقایسه شدند.
-3نتایج و بحث
کلنیهای مخمردر نمونههای کشت شده مانند از درختان بادام و زردآلو کلونیهای غالب بودند. در مشاهده میکروسکوپی، سلول-های 3 تا 8 میکرومتری که در حال جوانه زدن بودند مشاهده شد. کلنیها رنگشان کرم تا صورتی کمرنگ بود. تعدادی از مخمرها به نمایندگی انتخاب و بررسی شدند. همه جدایهها کاتالاز و اورهآز مثبت، و قادر به هیدرولیز اسکولین و نشاسته و احیای نیترات بودند. جدایهها اکسیداز منفی، متیل رد منفی، وتولید آرژنین دی هیدرولاز نیز منفی بودند. در واکنش PCR قطعه 600 جفت بازی در تمامی نمونهها - با الکتروفورز در ژل آگارز یک درصد و رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید - مشاهده گردید . توالی قطعه مذکور دارای بالاترین تشابه - %99 - با توالی آن در کونهی Creptococcus adeliensis بود. لذا در استان فارس علاوه بر شانکر ناشی از P.syringae pv. Syringae ، شانکر مخمری نیز در درختان هستهدار شامل بادام و زردآلو و هلو وجود دارد.
