بخشی از مقاله
مقدمه :
بیفیدوباکتریوم ها اولین بار در سال ۶١٩٠ توسط Tissier از مدفوع نوزادان تغذیه شده با شیر مادر در انستیتو پاستور پاریس جداسازی شد. از ان پس خواص سلامت بخش زیادی به ان نسبت داده شد . امروزه از این باکتری بطور وسیع درمحصولات پروبیوتیکی شامل انواع محصولات لبنی، نوشیدنی های پروبیوتیک و به خصوص شیر خشک نوزادان استفاده می شود و تلاش های زیادی توسط محققین برای به دست آوردن سویههای جدید از منابع مختلف در حال انجام است . به نظر می رسد که محصولات لبنی بومی کاندیدهای مناسبی جهت جداسازی سویههای بیفیدوباکتریوم باشد. لذا در این تحقیق سعی بر این شده که در ابتدا با استفاده از محیط های کشت مناسب اقدام به جداسازی باکتری فوق از محصولات لبنی بومی وسپس شناسایی توسط آزمونهای بیوشیمیایی و مولکولی لازم جهت شناسایی کامل این باکتریها انجام گیرد.
٢ مواد و روش ها
٢-١ نمونه برداری :
از آنجایی که هدف از این تحقیق جداسازی سویه های بیفیدوباکتریوم از محصولا لبنی بومی بود، دستیابی به محصولات لبنی که فلور بومی منطقه در آن حفظ شده از اهمیت زیادی برخوردار بود . لذا برای نمونه برداری مناطقی انتخاب گردید که کاملا بکر باشد. از این جهت مناطقی از شمال غرب کشور شامل تلقیح شد. استانهای کردستان، کرمانشاه، ایلام و لرستان جهت نمونه بردلری انتخاب گردید و نمونه ها با استفاده از محیط ترانسپورت و به آزمایشگاه انتقال داده شدند .
٢-٢ مواد و محیط های کشت لازم :
سویه های به کاربرده در این تحقیق شامل سویه های مثبت استاندارد بیفیدوباکتریوم شامل بیفیدوباکتریوم بیفیدو - - PTCC 1644 ، بیفیدوباکتریوم انیمالیس - - PTCC 1631 وبیفیدوباکتر انگولاتوم - PTCC1366 - سه سویه استاندارد لاکتوباسیلوس کازیی - PTCC1608 - ، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس - PTCC 1643 - و لاکتوکوکوس لاکتیس - PTCC 1336 - به عنوان سویه منفی و ١٢٠ محصول لبنی بومی جهت بررسی وجود باکتری بیفیدوباکتریوم بود که به طور هم زمان مورد آزمون قرار گرفتند.
٢-٣ روش کار :
در ابتدا حدود ٢ گرم از نمونه جهت غنی سازی به داخل محیط کشت مایع m-MRS تلقیح گردید و در شرایط بیهوازی و دمای٣٧درجه سانتیگراد به مدت ٧٢ ساعت گرمخانه گذاری گردید ، از آشت های آزمایشگاهی بدست آمده در محیط غنیآننده m-MRS به آمک یک لوپ سترون در سطح محیطهای آشت انتخابی BFM و MRS-NLPN و MRS- R کلیه کشت ها در دمای °C ٣٧ و شرایط بیهوازی گرمخانه گذاری گردید و پس از ٧٢ ساعت پلیت ها را جهت یافتن کلنی های مشخص و یا مشکوک به بیفیدوباکتریوم مورد بررسی قرار دادیم .
٢-۴ آزمون های تائیدی:
با استفاده از کلنی های مشخص و مشکوک بیفیدوباکتریوم جدا شده از محیط های انتخابی، آزمون های اختصاصی ،مقاومت به میوپیروسین با استفاده از محیط اختصاصی BSMو دیسک و آزمون فروکتوز۶ فسفات فسفوکتولازانجام گرفت
٢-۵ روش مولکولی :
استخراج DNA با استفاده ازاستاندارد بین المللی ٧١۵٢١و تحقیقات انجام شده توسط Mayer انجام پذیرفت، برای تأیید وجود بیفیدوباکتریوم در نمونه های جداسازی شده، ناحیه متغیرV از SrDNA۶١ بطول ٢٣۵ جفت باز و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی Bif164 و Bif662منتشر شده توسط Kokدر سال ۶١٩٩تکثیر شد،و همچنین ناحیه متغیرV9 از SrDNA۶١ بطول ٠۵١٣جفت باز و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی Lm3 و Lm26منتشر شده توسط Kauffman در سال ١٩٩٩تکثیر شد .
پس از انجام PCR، به منظور بررسی وجود یا عدم وجود محصول مورد نظر و ا طمینان از انجام کامل و صحیح واکنش محصول PCR با استفاده ار ژل اگارز یک درصد الکتروفورز گردید در نهایت براي اطمینان از اختصاصی بودن آزمایش، بهترین روش تعیین توالی محصول PCR و مقایسه آن با ژنوم باآتري بیفیدو باآترم و سایر ژنهاي موجود در بانک ژن می باشد. بدین منظور ابتدا محصول PCR خالص سازي و سپس تعیین توالی گردد. نتایج حاصل از توالی محصولات PCR نمونه های مورد آزمایش با توالی های موجود در بانک ژن با برنامه Blast مقایسه گردید. با این کار میزان تشابه نمونه های توالی شده با توالی موجود در بانک ژن مقایسه شد.
٣ نتایج وبحث :
هدف از این تحقیق شناسایی سویه های بومی در جهت امکان سنجی استفاده از آنها در تولید محصولات پروبیوتیک و ارائه روش مناسب جهت جداسازی و شناسایی این باکتری در مواد غذایی جهت اهداف نظارتی و کنترلی بود. طبق دستورالعمل کدکس روش تشخیص گونه باآتريهای پروبیوتیک باید با استفاده ازمتداولترین و معتبرترین روشها ایهگذاری شود، و توصیه شده که ترآیبی از آزمایشات فنوتیپیک و ژنتیک به طور هم زمان مورد استفاده قرار بگیرند ما در مطالعات خود با استفاده از انواع محیط های کشت، آزمون های بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی و تشخیص مولکولی به جداسازی سویه های بومی پرداختیم و به نتایج زیر دست یافتیم : محیط کشت MRS به عنوان یک محیط کشت مرجع برای کشت سویه های پروبیوتیک شناخته شد، ترکیباتی چون عصاره مخمر، پپتون، سیستین و نشاسته برای بیفیدوباکتریومها ضروری به نظر میرسد که در ترکیبات m-MRS داخل شدهاند علاوه براین عصاره مخمر به عنوان یک ارتقاء دهنده عالی رشد در نظر گرفته شده است.
اضافه کردن ال سیستئین به منظور پایین آوردن پتانسیل اکسید واحیاء در این محیط کشت شرایط بیهوازی بهتری را برای رشد بیفیدوباکتریوم فراهم کرد این آمینو اسید همچنین به عنوان یک منبع نیتروژن اساسی برای بیفیدوباکتریومها مورد استفاده قرار می گیرد. اگرچه m-MRS برای بیفیدوباکتریوم ها انتخابی نیست اما این محیط کشت برای شمارش آنها از کشت های آزمایشگاهی خالص توصیه می شود محیط MRS- R بازیافت خیلی خوبی را از کشت های مخلوط به دست داد اما قدرت افتراق مناسبی را در جداسازی بیفیدوباکتریوم ها از سایرسویهها دارا نبود و اکثر سویههای همراه به خصوص لاکتوباسیلوس ها بر روی این محیط رشد داشتند .
اجزای تشکیل دهنده MRS-NLPN به شکل گستردهای جهت شمارش انتخابی بیفیدوباکتریوم ها مورد استفاده قرار می گیرند. سولفات نئومایسین و اسید نالیدیکسیک به عنوان بازدارنده های رشد باکتریهای میله ای گرم مثبت و گرم منفی هستند همچنین کلرید لیتیم عموما به عنوان یک عامل انتخاب کننده در شمارش مربوط به بیفیدوباکتریوم مورد استفاده قرار میگیرد.اگرچه Talwakar در سال ۴٢٠٠ این محیط را یکی از تمایز دهنده ترین محیط های کشت برای شمارش بیفیدوباکتریوم ها در کشت های مخلوط دانست اما نتایج ما حاکی ازرشد سایر سویه ها به خصوص لاکتوباسیل ها را در این محیط کشت بود.
بنابراین این محیط گرچه بازیافت بسیار خوبی از بیفیدوباکتریوم ها را فراهم می کند اما مهارکنندگی لازم را در خصوص سایر سویه های لاکتیک به خصوص لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس نشان نمی دهد. کلیه سویه های مثبت بر روی محیط BFM کلنی های آبی رنگ گردی را با قطر تقریبا ٢ میلیمتر ،بعد از خارج کردن پلیت ها از شرایط بیهوازی ایجاد کردند. هیچ کدام از سویه های لاکتوباسیلوس و لاکتوکوکوس که به عنوان کنترل منفی در این تحقیق به کار رفتند، در این محیط کشت رشدی را نشان ندادند.
