بخشی از مقاله
مقدمه و هدف
کلی باسیلوزیس بیماریی است که توسط باکتري اشریشیاکولی - E.coli - ایجاد می شود. کلی باسیلوزیس همچنین با نام خون ریزي مخاط روده ي بزرگ - Hemorrhagic colitis - شناخته شده است. E.coli O157:H7 مهمترین سروتیپ سویه هاي انتروهمراژیک اشریشیاکلی - EHEC - است که در ایجاد بیماري هاي منتقل شونده به وسیله موادغذایی نقش دارد - . - 1 در بین حیوانات گاو به عنوان مهمترین مخزن این باکتري می باشد و نکته مهم عدم بیماري زایی این سویه اشریشیاکلی - E.coli O157:H7 - در گاو می باشد 1 - ،. - 2اگرچه گوسفند، بز،خوك، سگ، گربه، بوقلمون، جوجه و غاز نیز به عنوان مخازن این باکتري گزارش شده اند . - 1,3,4 - آلودگی هاي سویه هاي انتروهموراژیک به ویژه سروتیپ اغلب به واسطه مصرف همبرگر ، گوشت چرخ کرده ، شیر خام و دیگرمحصولات گا وي می باشد.
بنابراین گاوسانان به عنوان مخازن اولیه باکتري در نظر گرفته می شوند . البته این باکتري را می توان از برخی حیوانات دیگر هم جداسازي نمود. حشرات نیز در نتیجه ارتباطی که با کود و مدفوع حیوانات دارند باعث انتشار این باکتري در محیط می شوند. با توجه به امکان انتقال E.coli O157:H7 حشرات به ویژه در فصل تابستان، حشرات نقش مهمی را در اکولوژي وانتقال این پاتوژن در ماه هاي در ماه هاي تابستان دارند . در تمامی افراد احتمال آلودگی با این باکتري وجود دارد، اما کودکان و افراد مسن مستعد تر هستند 5 - ،7،. - 6 در سال 1993 گزارشی مربوط به آلودگی 732 نفر درآمریکا که منجربه مرگ 4 نفر گردید و که همبرگر نیم پزعلت آن معرفی گردید - . - 8
در گزارش دیگري در سال 1997، گوشت چرخ کرده وهمبرگرعامل متداول براي وقوع E.coli O157:H7 بیان شد - . - 9 هموژن بودن این سویه از نظر ژنتیکی سبب یافتن روش هاي زیادي براي جداسازي این سویه ها نظیر عدم قدرت تخمیر سوربیتول و عدم تولید بتا.دي. گلوکورونیداز است که بیشتر انواع اشرشیا کلی قادر به انجام دادن آن می باشند. از این جهت با ساختن محیط هاي انتخابی نظیر سوربیتول مکانکی آگار، سفیکسیم پتاسیم تلوریت سوربیتول مکانکی آگار و سفیکسیم پتاسیم تلوریت رامنوز سوربیتول مکانکی آگار میتوان این سویه ها را غربالگري کرد . از دیگر روش دقیق ردیابی این پاتوژن روش ملکولی - - PCR
می باشد، که در سالهاي اخیر مورد توجه قرار گرفته است - . - 10 اگر چه در ایران مطالعات زیادي در مورد شناسایی عوامل ایجاد کننده اسهال هموراژیک انجام شده است، اما تاکنون در ارتباط با اسهال ناشی از سویه هاي EHEC به ویژه در مورد سروتیپ E.coli O157:H7مطالعه جامع اي صورت نگرفته است. در مقایسه با سایر پاتوژ ن هاي روده اي به ویژه سالمونلا و شیگلا و مقاومت آن در برابر اکثر آنتیبیوتیک ها، ضرورت شناسایی منابع آلودگی و چگونگی انتقال آن به انسان وجود دارد. هدف از این پژوهش ، جداسازي و تعیین مقاومت آنتی بیوتیکی سویه هاي اشریشیاکلی تولید کننده شیگاتوکسین از گوشت گاوهاي کشتارشده، کشتارگاه صنعتی شهر کرمان میباشد.
واژه هاي کلیدي: کلی باسیلوزیس- - E.coli O157:H7 شیگاتوکسین- مقاومت آنتی بیوتیکی
مواد و روش ها
این مطالعه توصیفی- تحلیلی از فروردین تا بهمن 1395 انجام پذیرفت . در مجموع 400 نمونه از لاشه هاي گاوهاي کشتار شده در شهر کرمان جمع آوري گردید. نمونه گیري در انتهاي خط کشتار و در شرایط استریل از برش سطحی عضله گردن در اندازه 10×10×0/3سانتیمتر انجام گرفت و پس از هر بار نمونه گیري نمونه ها در کنار یخ و با رعایت اصول استاندارد به آزمایشگاه تخصصی میکروبیولوژِي منتقل و حد اکثر ظرف 12 ساعت پس از نمونه گیري از نظر آلودگی اشرشیا کلی O157:H7 مورد ارزیابی قرار گرفته و مراحل جداسازي انجام می پذیرفت. تعداد نمونه هاي اخذ شده در فصول بهار، تابستان، پاییز و زمستان هرکدام 50 عدد بود که بر اساس مطالعات مشابه در نظر گرفته شد 11 - ،. - 10
جهت جستجوي اشرشیا کلی و اشرشیاکلی O157:H7، 10 گرم از هر نمونه به صورت هموژن شده به 90 میلی لیتر آبگوشت تریپتون سوي - TSB - ساخت شرکت مرك آلمان حاوي مکمل نووبیوسین - 20mg/l - اضافه شد و براي18-24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. در ادامه 100 میکرولیتر از نمونه غنی شده مورد نظر در محیط ائوزین متیلن بلو و مک کانکی سوربیتول دار - SMA - ساخت شرکت مرك آلمان حاوي مکمل سفکسیم و تلئوریت پتاسیم کشت و بمدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. جهت تائید تشخیص پرگنه هاي مشکوك اشرشیاکلی از کشت بر روي محیط تریپل شوگر آیرون - TSI - و آزمون آیم ویک - IM ViC - استفاده شد . - 12 -
همچنین پرگنه هاي سوربیتول منفی جهت تائید تشخیص اشرشیا کلیO157:H7 به وسیله PCR با استفاده از دو پرایمر مخصوص تشخیص ژن هاي O157 و - fiC - H7 مورد بررسی قرار گرفت 14 - و - 13 - جدول شماره . - 1 جهت استخراج DNA از کیت استخراج DNA ساخت شرکت سیناژن ایران استفاده شد. کمیت و کیفیت DNAاستخراج شده به دو روش اسپکترومتري با طول موج 260 نانومتر و الکتروفورز روي ژل آگارز 1 درصد مورد ارزیابی قرار گرفت. DNAاستخراج شده تا زمان انجام PCR در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. - . - 10 در این مطالعه از سوش استاندارد آزمایشگاهی اشرشیاکلی O157:H7 به عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.
الگوي مقاومت داروئی
براي تعیین حساسیت اشریشیاکلی جدا سازي شده به ترکیبات ضدباکتریایی، از روش انتشاردیسک استفاده گردید. ابتدا کلنی ها را در محیط مایع مولرهینتون به نیم مک فورلان رسانده، سپس از آن برروي محیط کشت مولر هینتون آگار، کشت تهیه کرده وهمزمان دیسک حاوي آنتی بیوتیک خریداري شده از شرکت پادتن طب بر روي محیط کشت قرار داده شد. پس از 24ساعت انکوباسیون در دماي37◦Cقطر هاله عدم رشد سالمونلاها تعیین گردید. براي آزمایش آنتی بیوگرام از 4 دیسک آنتی بیوتیک شامل: پنی سیلین - - 10 gμ، آمپی سیلین - - 10 gμ ، تتراسیکلین - - 30 gμ ، کانامایسین - 30 gμ - وکلرآمنیکل - 10 gμ - استفاده شد - جدول . - 2 نتایج تعیین حساسیت اشریشیاکلی هاي جداسازي شده به ترکیبات ضد باکتریایی بر اساس درصد درسه سطح حساس، نیمه حساس و مقاوم - بر اساس جدول شرکت پادتن طب از تعداد نمونه هاي اشریشیاکلی - ارزیابی گردید - استفاده ازروش استاندارد . - 15 - - Kirby & Bauer
یافته ها وبحث
نتایج حاصل از پژهش نشان داد از مجموع 400 نمونه مورد بررسی در فصول مختلف سال در مجموع 210 نمونه به باکتري هاي مختلف آلوده بودند. از این میان 33 مورد طبق آزمایشات میکروبی وبیوشیمیایی آلوده به اشریشیاکلی بود. ودر نهایت توسط تسست تشخیصیPCR مشخص گردید 22 نمونه از 60 نمونه اشریشیاکلی سویه O157:H7 بود که هر 22 نمونه آلوده متعلق به فصل تابستان بود. نتایج حاصل از بررسی حساسیتE.coli O157:H7 در برابر آنتی بیوتیکهاي مورد بررسی نشان دهنده مقاومت تمامی باکتريها در برابر آنتی بیوتیک هاي پنی سیلین، اریترومایسین وآمپی سیلین بود. همچنین درصد بالاي به دیگر آنتی بیوتیک ها مقاومت نشان دادند؛ 76/66 درصد به سفالکسین و جنتا میسین مقاوم بودند - جدول. - 2 ولی تمامی نمونه ها به کلرآمفینیکل حساس بودند.
باکتري اشرشیاکلی O157:H7 از جمله باکتریهایی است که در سال هاي اخیر باعث همه گیري هایی در برخی از نفاط جهان شده است و توجه محققان و دست اندرکاران بهداشتی را به خود معطوف نموده است. با توجه به اینکه عامل اصلی انتشار مخزن اصلی اشرشیاکلیO157:H7 گاو و محصولات و گزارش هاي موجود مربوط به آلودگی این محصولات بوده است - . - 16,17 شیوع این پاتوژن در گوشت و محصولات حاصل از گوشت گاو بین 0 تا 27/8 در صد گزارش شده است 17 - ،18،. - 19 در مطالعه حاضر مشخص گردید1/5 درصد نمونه ها آلوده به اشریشاکولیO157:H7 بودند که با مطالعه اي که توسط تهمتن وهمکاران در سال 2006 در مورد گوشت گوساله ها در انتهاي خط کشتار در کشتارگاه صنعتی شراز صورت گرفته بود و نشان داد آلودگی در بین گوشت هاي کشتار شده وجود دارد اما این آلودگی در حد بالیی نمی باشد وبین صفر تا 8 درصد نوسان دارد - . - 20
مطابقت دارد. همچنین با مطالعت دیگر که در کشور هاي مختلف صورت گرفته است آلودگی اشرشیاکلیO157:H7 در گوشت گاو کشور هلند - 10/4% - ، انگلیس - 13/4% - آمریکا - 28% - بوده که از میزان اندازه گیري شده در این مطالعه بیشتر می باشد 21 - ، 28، . - 29 همخوانی دارد . در این مطالعه آلودگی و جداسازي اشریشاکولیO157:H7 فقط فصل تابستان بود که Hancock، Elder این موضوع را تایید می نماید - . - 21 ,22 باکتري هاي اشریشاکولیO157:H7 جداسازي شده ازنمونه هاي کلینیکی، مواد غذایی و نمونه هاي حیوانی طی بررسی هاي گوناگون، مقاومت آنتی بیوتیکی بالایی را از خود نشان داده اند. یکی ازمسایلی که باعث افزایش اهمیت اشریشاکولیO157:H7 می شود، وجود مقاومت آنتی بیوتیکی در این باکتري است. بررسی هاي مختلف بر روي سویه هاي جداسازي شده درهمه گیري ها و موارد تک گیر در نقاط مختلف جهان نشاندهنده این مسأله است که این سویه به طیف گسترده اي از آنتی بیوتیک ها مقاوم ا ست و یا حساسیت پایینی دارد - . - 23
