بخشی از مقاله
چکیده
بازیابی و خالصسازي یک مولکول از مخلوطی که در آن قرار گرفته است، بسیار پیچیده، سخت و هزینهبر میباشد. تاکنون تعدادي فرایندهاي متوالی از قبیل استخراج، فراکسیونگیريهاي مکرر، رسوبگیريها، انحلالها، تقطیرها و نظیر این مسائل، براي این منظور استفاده شدهاند که همگی آنها ناکارآمد بودهاند. در واقع، بازده فرایند خالصسازي در اثر فرایندهاي متوالی بسیار کاهش مییابد و هزینههاي بازیابی آن نیز به حداکثر خواهد رسید. هر گاه از مواد طبیعی براي جذب استفاده شود، به این فرایند جذب زیستی میگویند که میتوان براي بازیابی ترکیبات باارزش از آن استفاده نمود. در فرایند جذب زیستی در طی یک مرحله میتوان یک مولکول ویژه را از میان مخلوطی از چند صد ترکیب دیگر جداسازي نمود. یک مثال از چنین ترکیبات زیستی کارامد و فوقالعاده حساس که به طور طبیعی به وسیله سیستمهاي زنده تولید میشوند آنتی باديها هستند که توسط سیستم ایمنی تولید شده و قادر به شناسایی و حذف یک نوع ویژه از مولکول هدف میباشد. بنابراین، آنتیباديها جوهرهي جذبکنندههاي زیستی سیستم ایمنی هستند. آنتیباديهاي باارزش را میتوان از یک مخلوط، به وسیله فرایند تثبیت مولکول هدف آنتیبادي - براي مثال یک مولکول پروتئین - که به منظور به دام انداختن آنتیبادي استفاده میشود، بازیابی نمود.
کلمات کلیدي: جذب زیستی، آنتی بادي تک دودمانی، بازیابی مولکول، خالص سازي، سیستم ایمنی
-1 تولید آنتی باديهاي تکدودمانی
آنتی بادي - Ab - یک گیلکوپروتئین است که مستقیماً بر روي یک آنتیژن - Ag - قرار میگیرد. آنتی ژن، مادهاي است که میتواند پاسخ ایمنی را در بدن برانگیخته کند. آنتی باديها از دو نوع زنجیره پپتیدي تشکیل شدهاند: یک جفت زنجیره سبک - هر کدام در حدود - 25 Kd و یک جفت زنجیره سنگین - هر کدام در حدود 50 تا . - 77 Kd هر کدام از زنجیره هاي سنگین و سبک سطوحی - دومین یا ناحیه - دارند که جهش سوماتیک با بیشترین احتمال در آن رخ میدهد و در نتیجه توالی پروتئین حاصله به شدت متغییر می باشد - که جایگاه اتصال آنتی بادي را هم شامل میشود - . هر دو زنجیره سبک و سنگین نواحی یا دومینهایی دارند که توالی پروتئینی در آن به شدت ثابت بوده و هیچ تغییري در آن رخ نمیدهد.
ناحیه ثابت زنجیرهي سنگین آنتیبادي، ایزوتایپ آنتیبادي را تعیین می کند. ایزوتایپ لفظی است که براي توضیح یک آنتیبادي بر اساس ناحیه حفاظت شده زنجیره سنگین استفاده میشود. پنج ایزوتایپ تاکنون شناخته شده است IgG, IgM, IgA, IgD - و - IgE و براي برخی ایزوتایپها همچنین زیر کلاس هایی نیز تعیین میشود - مانند . - IgG, gIA نه تنها آنتی بادي به آنتیژن متصل میشود بلکه بر اساس زنجیره ثابت آن عملکردهاي ویژهي دیگري نیز دارد. به طور مثال، IgG انسانی میتواند از کیسهي جنینی عبور نماید. بارالکتریکی، آبگریزي و حلالیت یک پروتئین به وسیله زنجیرههاي جانبی باقیماندههاي اسیدآمینهاي تشکیل دهنده پروتئین تعیین میشود. آنتیباديهاي تک دودمانی، آنتیباديهایی هستتند که داراي خاصیت انتخابی یکسان در برابر آنتی ژن هستند.
در سال 1975 جورج کوهلر و سزار میلستین یک مقاله کوتاه ارائه کردند - 4 - که روش جدید آنها براي تولید آنتیبادي تک دودمانی را شرح میداد، به طوري که با استفاده از سلولهاي هیبریدوما به طور پیوسته موفق به تولید آنتیبادي تکدودمانی شدند. سلول هیبریدوما، سلولی است که از تلفیق زیستی یک سلول لنفوئیدي میرا، تولید کنندهآنتی بادي، و یک سلول میلوماي نامیرا بنیان یافته است. براي تولید آنتیبادي تکدودمانی، سلولها باید در یکی از دو روش زیر رشد کنند: از طریق تزریق در حفرهي صفاقی در یک موش مناسب که از قبل آماده شده است - روش in vivo یا روش آسیت موشی - ، یا به وسیله روش کشت بافت در in vitro روش. آسیت موشی یک روش کاملاً شناخته شده است و روشی است که در اکثر آزمایشگاها انجام میشود. این در حالی است که پیشرفتهاي روز افزون در زمینه تکنولوژيهاي in vitro، امتیازهاي فراوانی را ارائه میدهد و فشار عمومی براي جایگزینی و یا کاهش استفاده از حیوانات آزمایشگاهی را افزایش داده است.
علاوه بر این، روشهاي مدرن in vitro در برابر روشهاي آسیت یا همان in vivo هزینههاي کمتري را در بر می گیرند، خصوصاً زمانی که افزایش مقیاس - scale-up - مورد نیاز باشد. آنتیباديهاي تکدودمانی ابزار فوق العاده ارزشمندي در هر یک از دو زمینه تحقیقات و کلینیکال هستند. آنها در in vitro به عنوان عناصر شرکت کننده در سنجشهاي ایمونولوژیک، به عنوان سنسورهاي زیستی، در خالصسازي تمایلی، مرتبسازي سلولها با فلورسنت فعال شده یا روش - FACS - و به عنوان آنتیبادي هایی با عملکرد آنزیمی، مورد استفاده قرار میگیرند. همچنین، آنتیباديهاي تک دودمانی به صورت روتین در تستهاي ELISA و IFA نیز استفاده میشوند. زمانی که آنتیباديهاي تکدودمانی به منظور استفاده به عنوان لیگاند در کروماتوگرافی تمایلی تولید می شوند، به طور کلی روش آسیت انجام میگیرد.
-1-1 روشهاي تولید در in vivo
روشهاي in vivo استفاده از موشهاي خانگی یا صحرایی را شامل میشوند، با مراحل زیر : - 1 -
- 1 سیستم ایمنی حیوان جهت تولید آنتیبادي تحریک میشود.
- 2 سلولهاي تولید کننده آنتیبادي از طحال جداسازي شده و با سلولهاي توموري نامیرا که به صورت جداگانه رشد داده شدهاند آمیخته میشوند = ساخت سلول هیبریدوما
- 3 سلولهاي هیبریدوما، جهت جداسازي سلولهاي تولید کننده آنتیبادي، گزینش شده و بهترین ردهي سلولی تکثیر داده شده و به عنوان سلولهاي آغازگر مورد استفاده قرار میگیرند.
- 4 تزریق داخل صفاقی از یک رده سلولی در یک موش
- 5 رشد سلولهاي توموري تولید کننده آنتیبادي تکدودمانی در حفرهي صفاقی: مدت زمان ترشح آنتیبادي و زمان بقاء حیوان تولید کننده به تعداد و میزان شدت پیشرفت تومورهاي تزریق شده وابسته است.
- 6 تولید in vivo از نتایج حاصل از روش آسیت.
- 7 خونگیري از حیوان براي بهرهبرداري از روش آسیت.
روشهاي تولید کننده در in vitro مزایاي فراوانی در مقایسه با تولید در روش آسیت را ارائه میدهند. صرفنظر از نگرانیهاي آشکار عمومی در مورد حیوانات، روشهاي in vitro به راحتی قابل افزایش مقیاس هستند تا بتوان حجم بالاتري را تولید نمود، اما با هزینه کمتر در مقایسه با روش .in vivo تعدادي از سیستمهاي in vitro آنتیباديهاي تکدودمانی را در غلظتهاي برابر یا بالاتر نسبت به روش آسیت تولید میکنند. سه روش جهت کسب آنتیبادي تک دودمانی با بازده بالا در in vitro وجود دارد: کشت در مقیاس بالا، کشت در تراکم بالا و افزایش بازدهی یک سلول در کشت. به طور متداول، تصحیح ترکیبات اثرگذار در محیط کشت، سبک عملکرد و طراحی راکتور زیستی، در کانون توجه قرار دارد. سرم جنین گاوي، به طور معمول سرم جنین گوساله - FCS - ، در بیشتر محیط هاي کشت بافت مورد استفاده قرار میگیرد. بیشتر معایب سرم گاوي قیمت بالاي آنها و خطر آلودگی بوسیله ایمونوگلوبولینهاي گاوي است، که خواستار خالصسازي دقیقتري است. به عنوان یک تجربه، استفاده از محیط فاقد پروتئین و سرم به تدریج یکی از اهداف کشت سلول شده است، مطالعاتی به منظور اثبات افزایش تولید آنتیباديهاي تک دودمانی با استفاده از محیط کشت فاقد سرم انجام شده است .
-2-1 روشهاي تولید در in vitro
بدون وارد شدن در جزئیات، سبکهاي معمول متفاوتی از تکثیر کشت سلول مورد استفاده قرار میگیرد: کشت غیر مداوم، کشت غیر مداوم خوراكدهی شده، کشت مداوم، کشت تزریقی و برخی روشهاي اختصاصیتر. کیفیت آنتیبادي مطلوب اغلب سیستم کشت و راکتور زیستی مورد استفاده را تعیین میکند. در ادامه، جدول 1 اطلاعاتی را در مورد نوع راکتور زیستی مورد استفاده وابسته به کیفیت آنتیبادي مورد نظر میدهد. لیست تکنولوژيهاي in vitro وسیع است، اما میتواند به طور کلی دستهبندي شود. فلاسکهاي کشت بافت، کیسههاي کشت بافت نفوذپذیر به گاز، بطريهاي گردان و فلاسکهاي چرخشی، تانکهاي همزندار و راکتورهاي هوا بالابرنده، غشاءهاي دیالیز و راکتورهاي بستر سیال منشعب، راکتورهاي الیاف متخلخل، ممکن است پدیدار شدن تکنولوژيهاي تولید آنتیباديهاي تک دودمانی، نوترکیبی ژنتیکی را دربرگیرد و موارد زیر را شامل شود: آشکار سازي فاژ، گیاهان تراریخته، حیوانات تراریخته . - 3 -
-2 خالصسازي و کاربرد آنتی باديهاي تکدودمانی
روشهاي فراوانی براي خالصسازي آنتیباديهاي تک دودمانی وجود دارد. تکنیکهاي مرسوم از قبیل رسوبگیري - با آمونیوم سولفات و یا اسید کاپریلیک - ، کروماتوگرافی تعویض یونی و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی به طور وسیعی در گذشته و در خالصسازي آنتیباديهاي تک دودمانی مورد استفاده قرار میگرفتند، و آنها هنوز در برخی مراحل خالصسازي مفید واقع میشوند. هر چند به نظر میرسد که امروزه شیوههاي بر پایه تمایل جذب بر اساس پروتئین A یا پروتئین G ، معمولترین روشهاي مورد استفاده براي خالصسازي آنتیبادي باشند خالصسازيهایی که در آنها از این واکنشگرهاي تمایلی استفاده میشوند،نسبتاً سادهمیباشند و به طور کلی یک درجه بیهمتایی در برابر روشهاي قدیمی ایجاد میکند.
همهي روشها محدودیتهایی دارند و پروتئین A و پروتئین G با همهي انواع آنتیباديها پیوند کاملاً برابري ایجاد نمیکنند . دیگر روشهاي بر پایه تمایل شامل دستهاي میباشند که از پروتئین L، لیگاندهاي پپتیدو میمتیک، آنتی ایمنوگلوبولینها، یا آنتیژن مربوطه بهره میبرند. روشهاي ایمونوژنتیک تلفیقی از یک واکنشگر تمایلی - براي مثال، پروتئین A یا یک آنتی ایمونوگلوبولین - با ذرات گلولهاي پارامغناطیسی میباشند که سهولت در جداسازي را باعث میشوند. همچنین، خالصسازي آنتیباديها با دیگر تکنیکهاي کروماتوگرافی، شامل کروماتوگرافی بر پایه واکنشهاي آبگریزي و سولفوردوستی، جزء روشهاي محبوب خالصسازي بهشمار میروند.
از آنجا که آنتیباديها گلیکوپروتئین هستند، مشخصات آنها به عنوان یک پروتئین، روشهاي مورد استفاده براي بازیابی و خالصسازي آنها را تعیین مینماید. تعدادي دیگر از پارامترها در هنگام برنامهریزي جهت خالصسازي آنتیبادي باید مورد بررسی قرار گیرد : - 2 - هدف استفاده از آنتی بادي: تشخیص ایمنولوژیک، برچسبهاي ایمنیولوژیک، واکنشگرهاي تمایلی ایمنولوژیک، درجه خلوص مورد نیاز، بازدهی و خلوص، منبع آنتیبادي: آبصفاق، سرم، سوپرناتانت کشت سلول - ایستا یا راکتور زیستی - ، گونههاي میزبان، ایزوتایپ، مقدار در دسترس، ابنکه آیا روشهاي خالصسازي تمایل پیوند به آنتیژن و یا ناحیه FC را تغییر خواهند داد؟ و زمان و هزینه.
-1-2 روشهاي خالصسازي
روشهاي معمولی براي بازیابی و خالصسازي پروتئینها وجود دارد، از قبیل: اولترا و دیا فیلتراسیونرسوبگیري، معمولاًاز طریق نمک هاي سولفاته - آمونیوم یا سدیم - ، پلیمرهاي غیر یونی - مانند پلیاتیلنگلایکول - ، حلالها - مانند استون، اتانول و ... -
