بخشی از مقاله
خلاصه
برای انجام بسیاری از برنامه های اصلاحی، مطالعات تنوع زیستی، بررسیهای ملکولی و مطالعات کاربردی مربوط به قارچهای خوراکی و دارویی، حفظ گونههای وحشی از اهمیت بالایی برخوردار است. در این ارتباط، نگهداری ژرم پلاسم زنده از قارچهای وحشی، نقش بنیادین در شناسایی خصوصیات و نگهداری کامل آنها دارد. در این پژوهش حدود 70 نمونه از قارچهای کلاهکدار خوراکی و دارویی از مشهد و حومه جمع آوری شد و برای حفظ نمونهها کشت میسلیوم خالص و اسپور آنها تهیه شد. جهت کنترل صحت کشتهای میسلیوم و انطباق با نمونههای جمع آوری شده، استخراج DNA و تکثیر و آنالیز نواحی ITS ریبوزومی انجام شد.
64 کشت میسلیوم منطبق با گونههای جمع آوری شده بودند که به 13 جنس و 21 گونه تعلق داشتند. قارچهای جنس Agaricus با 6 گونه و Pleurotus با چهار گونه بیشترین فراوانی را داشتند. در جنس Agaricus گونههای A. bisporus و A. devoniensis بترتیب 25 و 11 نمونه را به خود اختصاص دادند. تجزیه و تحلیل نواحی ITS و نمودار فیلوژنی آنها نشان داد که در داخل هر گونه نیز تنوع وجود دارد، بطوریکه در A. devoniensis این تنوع کاملا مشهود بود. نتایج این پژوهش نشان داد که شهرستان مشهد دارای تنوع غنی از قارچهای وحشی خوراکی و دارویی است.
کلمات کلیدی: قارچ وحشی، زیست بانک، قارچ خوراکی، قارچ دارویی
مقدمه
در چند دهه اخیر با شناخت اهمیت نقش تنوع زیستی در حمایت از زندگی بشر و نگرانی عمیقی که در مورد کاهش تنوع زیستی وجود دارد، برنامههای حفظ و نگهداری از تنوع زیستی موجودات و از جمله قارچها در جهان مورد توجه قرار گرفته است. قارچها به لحاظ تغذیهای، دارویی و زیست پالایی اهمیت فراوان دارند. هر چند سابقه تحقیق در مورد آنها به ابتدای قرن بیستم میرسد، اما استفاده از آنها به عنوان غذا و دارو قدمتی طولانی دارد، به طور مثال قارچ Ganoderma lucidum حدود 4000 سال پیش از منابع دارویی بوده است 3]،2،.[1 گونههای وحشی همواره ذخایر ژنتیکی مهمی هستند که ژنوتیپهای مفید جهت اصلاح و بهبود کیفیت واریتههای تجاری را فراهم میآورند. به همین دلیل، جمعآوری، شناسایی و نگهداری ژنوتیپهای وحشی و استفاده از ژنهای مفید آنها در اصلاح نژادهای تجاری، از جمله راههای مناسب جهت بهبود کیفیت و کمیت قارچهای تولیدی میباشد .[3]
نواحی ITS که حاوی بخشهای چندشکل و محافظت شده میباشد، در تجزیه و تحلیل روابط ژنتیکی و تکاملی کاربرد زیادی دارد. با کاربرد آغازگرهای اختصاصی بر اساس نواحی بسیار محافظت شده آنها، چند شکلی ناشی از جانشینیهای بازی و تغییر در طول، آشکار خواهد شد که در مشخص ساختن روابط تاکسونومیکی و فیلوژنتیکی قابل استفاده میباشد. با استفاده از این توالیها، اختلاف بین جنسها و حتی ایزولههای یک جنس خاص، مشخص میشود 6]،5،.[4 چنانچه اظهار شده چون این نواحی هم در طول و هم در توالی بهشدت تغییرپذیر هستند، یک ابزار مناسب برای جداسازی محصولات تکثیری فراهم میسازند و بنابراین برای تعیین تفاوتهای بین و درون گونهای از نواحی کدکننده دیاناِی ریبوزومی مناسبتر میباشند .[5] این پژوهش در راستای شناسایی و حفظ تنوع قارچهای وحشی خوارکی و دارویی شهرستان مشهد جهت بهره برداری در پروژه های اصلاحی آینده انجام شد.
مواد وروشها
جمع آوری قارچهای کلاهکدار در اواخر اسفند و اوایل فروردین بعد از بارندگی و زمانی که رطوب کافی جهت رشد آنها وجود داشت انجام شد . نمونههای تازه بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند و در شرایط استریل از کلاهک آنها کشت میسلیوم و اسپور تهیه شد. برای حذف آلودگیهای باکتریایی به محیط کشت آنها آنتی بیوتیک جنتامایسین با غلظت 40 میلیگرم بر لیتر اضافه شد و در چند مرحله واکشت شدند. در زمانی که تهیه کشت خالص میسلیوم از طریق کشت کلاهک با شکست مواجه شد از طریق کشت اسپور قارچها احیا شدند.
استخراج DNA، از میسلیومهای رشد یافته در محیط مایع با استفاده از کیت BIO BASIC مطابق دستورالعمل انجام شد. جهت تکثیر کامل نواحی ITS از آغازگرهای ,765: 5 **$$*7$$$$*7&*7$$&$$* 3 و ,764: 5 7&&7&&*&77$77*$7$7*& 3 استفاده شد 8]،.[7 واکنشهای زنجیرهای پلیمراز در حجم 60 میکرولیتر به صورت: واسرشت اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه، 30 چرخه تکثیر شامل واسرشت در 94 درجه به مدت 45 ثانیه، اتصال آغازگر در 55 درجه به مدت 1 دقیقه، گسترش در 72 درجه به مدت 1 دقیقه و تکثیر نهایی در 72 درجه به مدت 5 دقیقه تنظیم گردید. محصولات تکثیری جهت توالییابی ارسال گردید و توالییابی بر اساس هر دو رشته قطعه تکثیری انجام گرفت . توالیها با استفاده از نرمافزار BioEdite - 7.2.5 - مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت و نتایج توالییابی با توالیهای موجود در NCBI مقایسه شد و گونه کشتهای خالص میسلیومی مشخص گردید و سپس درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA5 و روش Maximum Likelihood رسم گردید.
نتایج و بحث
حدود 70 نمونه از قارچهای کلاهکدار جمعآوری شد در شکل 1 تصاویر برخی نمونه ها نشان داده شده است. کشت خالص میسلیومی از آنها تهیه شد. نتایج مقایسه توالی نواحی ITS کشتهای خالص با توالیهای موجود در NCBI نشان داد تنها 64 نمونه مربوط به قارچهای کلاهکدار جمع آوری شده هستند و بقیه شامل میسلیوم قارچهای پارازیتی بودند قارچ اصلی را آلوده کرده بودند. بنابراین این نمونهها از دست رفتند که دو نمونه از آنها متعلق به قارچ مورچلا - Morchella - بود و نتوانستیم کشت خالص میسلیوم از این قارچ بدست بیاوریم. بر اساس نتایج تطابق توالی نواحی ITS با توالیهای موجود در NCBI نمونههایی که کشت خاص از آنها تهیه شده بودند در 13 جنس و 21 گونه قرار گرفتند که خلاصه از آن در جدول 1 است. نمونههای جنس Agaricus با 42 نمونه و گونه A. bisporus با 25 فراوانترین در نمونههای جمعآوری شده بودند . . این نتایج نشان میدهد که در منطقه مشهد گونههای متفاوتی از قارچهای کلاهکدار وحشی وجود دارد که برخی قابلیت خوراکی و برخی خواص دارویی دارند.
