بخشی از مقاله
مقدمه
ویــروس هــای خــانواده ارتومیکســوویریده (ویــروسهــای آنفلونزا) عامل عمدهای در ایجاد بیماری و مرگ و میرناشـی از بیمــاری تنفســی جمعیــت انســانی بــه شــمار مــیرونــد و
همهگیریهای آن اپیدمی جهانی ایجاد مـیکنـد. آنفلـونزا در سطح جهان درقرن اخیر باعث مرگ میلیـونهـا شـده اسـت
.(3)درهمه گیری بین سـالهـای 1918-1919 حـدود 20
میلیون انسان در اثر بیماری آنفلونزا تلف گردیدند و به دنبال این همه گیری مطالعات روی این بیماری بیشتر و سـریعتـر شده است(.(7 همچنین بیماریهای ناشـی از ویـروس هـای این خانواده در سایر گونهها بـه خصـوص پرنـدگان از نظـر اقتصادی بسیار با اهمیت بوده و علاوه بر خسـارات مسـتقیم ناشی از خود بیمـاری، کنتـرل، پیشـگیری و ریشـه کنـی آن بسیار پر هزینه است(.(4 عامل این بیماری متعلق به خانواده
ارتومیکسوویریده میباشد.درحال حاضر ویروسهـای ایـن
خانواده به سه تیپ C,B,A تقسیم بندی مـیشـوند کـه ایـن تیپها از نظـر الگوهـای اپیـدمیولوژیک بیمـاری در انسـان تفاوت های قابل توجهی دارنـد. بطوریکـه مـی تـوان گفـت
ویــروس آنفلــونزای نــوع A مهمتــرین تیــپ ایــن خــانواده ازنظربیماریزایی درانسان،پرندگان و برخی از پسـتانداران بـه
شــمار مــی رود ،درحالیکــه تیــپ هــایC,B تنهــا از انســان جداشده اند و بیماریزایی آنها درانسـان نسـبت بـه تیـپ A
کمتر است(17و 15، 11، 8، . (1 ویروس آنفلونزای تیپ A از لحاظ آنتی ژنی به شدت متغییر بوده و مسئول اکثر مـوارد اپیدمیهای گسترده آنفلونزا در سراسر جهان میبـاشد. تحـت
619
آیدین عزیزپور، سعید بکائی، نریمان شیخی، شهرام حبیبزاده
تیپهای ویروس آنفلونزای نوع A بر اساس دو گلیکو پـروتئین
هماگلوتینین((HA و نورآمینیداز((NA تعیین می شود که تـاکنون
16نــــــوع HA و9نــــــوعNA شناســــــایی شــــــده است(2،16،17،18،.(19در عفونتهای انسانی سه تحت تیپ
H3)HA تا (H1 و دو تحـت تیـپN2) NA و (N1 تحـت تیـپ
هایی بودند که بیشتر جدا شده اند. تحت تیپهـای H9, H7, H5
تحت تیپ های قابل انتقال ویروس آنفلونزای پرندگان به انسـان می باشد که تحت تیپهـای H7,H5 دارای بیمـاریزایی شـدید و
نوع H9دارای بیماریزایی خفیف است(8،10،.(19 ویروسهـای H9N2 علاوه بر ایران از کشورهای دیگر جهان از جمله آمریکـا
،آلمان، اتیالیا ،کره و چین از ماکیان و بوقلمون جدا شـده اسـت.
گزارشاتی مبنی به ابـتلاء انسـان بـه تحـت تیـپ H9N2 توسـط
محققین وجود دارد 15)و .(7 برخی مطالعـات انجـام شـده در نقاط مختلف جهان حاکی از آلودگی سرمی انسان به خصـوص افراد مرتبط با طیور درگیر به ویـروس آنفلـونزای طیـور تحـت تیپ H9N2 میباشد(13و 12، 10، 6، .(5 با توجه بـه ایـن کـه تحت تیپ H9N2 عامل بیمـاری آنفلـونزای مرغـی در جمعیـت طیور ایران در چند سال اخیر بوده اسـت. تـاکنون مطالعـهای در راستای بررسی میزان شیوع سـرمی ویـروس آنفلـونزای مرغـی درجامعه انسانی به خصوص افراد مرتبط و غیرمرتبط با صـنعت طیور در منطقه اردبیـل نشـده بـود.در ایـن تحقیـق بـه بررسـی سرولوژیکی حضور آنتی بـادیهـای ضـد ویـروس آنفلـوانزای
مرغی تحت تیپ H9N2 در پنچ گـروه جمعیـت انسـانی شـامل
بیماران با عوارض تنفسی بستری در بیمارسـتان، بیمـاران بـدون
عوارض تنفسی بستری در بیمارستان، پرسنل بهداشتی شاغل در
بیمارستان، مرغداران وکـارگران مرغـداریهـا و کشـتارگاههـای طیور و همچنین دامپزشـکان و واکسـیناتورها در منطقـه اردبیـل
پرداخته میشود.
مواد و روش کار
تعداد 311 نمونه سرم خون انسانی از دو گروه بیمار و سـالم بـا جنس و ردههای سنی مختلف از اوایل آبان تا اوایـل اسـفند مـاه سال 1388 جمع آوری گردید که گروه بیمار شـامل 86 نمونـه سرم خون بیماران بستری در بیمارستان با عوارض تنفسی و 88
نمونه سرم خون بیماران بسـتری در بیمارسـتان بـدون عـوارض تنفسی بودند .گـروه سـالم از جمعیـت انسـانی مـرتبط و غیـر مرتبط با صنعت طیور انتخاب گردید که شامل 41 نمونـه سـرم
خون دامپزشکان و واکسیناتورهای دامپزشـکی، 44 نمونـه سـرم
خون پرسنل بهداشتی بیمارستان امـام خمینـی(ره) و 52 نمونـه خون مرغداران و کـارگران مرغـداریها وکشـتارگاه هـای طیـور منطقه اردبیل بـود . در مـورد بیمـاران بسـتری در بیمارسـتان بـا مراجعـه بـه بخشـهای داخلـی زنـان، داخلـی مـردان و عفـونی بیمارستان و پس از مطالعه پرونده های بیماران بسـتری شـده در
بیمارستان امام خمینی(ره) بیماران با عوارض تنفسی (که عمـدتا
بدلایل پنومونی، تنگی نفـس و COPD بسـتری شـده بودنـد) و همچنین بیماران بدون عوارض تنفسی مشخص و پـس از اخـذ
موافقت از بیماران به میزان 3 سـی سـی از وریـد بـازویی آنهـا
خونگیری به عمل آمـد و در مـورد سـه گـروه دیگـر جمعیـت انسانی یعنی پرسنل بهداشـتی(عمدتا پزشـک، پرسـتار، کـاردان آزمایشگاه و کمک بهیار شاغل در بخشهای ICU، داخلـی زنـان، اورژانس، آزمایشگاه، داخلی مردان وعفونی بودنـد) ،دامپزشـکان
و واکســیناتورها (شــاغل در بخشــهای دولتــی و خصوصــی) و مرغداران وکـارگران مرغـداری هـا وکشـتارگاه هـای طیـور بـا مراجعه حضوری و پس از اخذ موافقت آنها عملیات خـونگیری با همان روش قبلی صورت گرفت. نمونههای خونی اخـذ شـده از گروههای مختلف مورد بررسی به داخل لوله آزمـایش انتقـال
و بلافاصله به بخش آزمایشگاه بیمارستان امـام (ره) ارسـال مـی
گردید که ابتدا نمونهها به مدت یک ساعت دردمـای آزمایشـگاه
نگهداری تا درلوله ها لخته تشکیل شـود و سـپس لولـه هـا بـه
مدت 12 سـاعت دریخچـال 4 درجـه سـانتیگراد نگهـداری و لخته نیز به کمک میله شیشه ای از جدار لوله جدا و بـا سـرعت 2000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ می شـدند و
620
بررسی حضور آنتیبادیهای سرمی ضد ویروس آنفلوانزای مرغی تحت تیپ H9N2 در جمعیت انسانی منطقه اردبیل
پس از جداسازی سرم حدود یک میلی لیتر از نمونه سـرم افـراد مورد نظر به لولههای اپندورف 1/5 میلی لیتر انتقال و در فریـزر منهای 20 درجه سانتیگراد تا انجام آزمایش نگهداری می شد تـا تعداد آنها به حد نصاب برسد.در نهایت تمام نمونههـای سـرمی
به بخش بیماریهای طیـور سـازمان دامپزشـکی و آزمایشـگاه پاستور دامپزشکی جهت جسـتجوی آنتـی بـادی ضـد ویـروس آنفلوانزای مرغی تحت تیپ H9N2 به روش HI منتقل شدند.
تست HI
الف: وسایل مورد نیاز
-1 فســـفات بـــافر ســـالین -2 (PBS)گلبـــول قرمـــز آمـــاده
شده(سوسپانسیون -3.(%0.5 آنتی ژن -4 سـرم مـورد آزمـایش -4 پلیت -5 میکروپیپت.
آماده سازی رقت سرم
جهت حذف آنتیبادیهای غیر اختصاصی ابتدا یـک قسـمت از
سرم بـا سـه قسـمت از آنـزیم (Receptor destroying RDE enzyme)رقیق و به مدت 24 ساعت در 37œC نگهـداری شـد و رقت حاصل به مـدت 30 دقیقـه در 56œC بـرای غیـر فعـال
شدن آنزیم قرار داده شد و سپس شش قسمت سرم فیزیولـوژی
به آن اضافه و رقت نهای سرم (1/10) بدست آمد.
ب: روش کار
ابتدا در تمامی 12 گوده (به جزءگـوده اول) یـک ردیـف افقـی پلیت با استفاده از میکروپیپت ،مقدار 25 میکرولیتر فسفات بـافر سالین((PBS با pH=7/6 ریخته شد. در مرحله بعـد بـه اولـین
گوده ردیـف فـوق مقـدار 50 میکرولیتـر از رقـت نهـای سـرم
(1/10) ریخته و در ادامه 25 میکرولیتر از محلول گوده اول بـه گوده دوم منتقل و به خوبی مخلوط گردید و پـس از آن، عمـل
رقیق سازی از گوده دوم به سوم تا آخرین گوده صورت گرفـت
و در نهایـت 25 میکرولیتـر از محلـول گـوده آخـر دور ریختــه شد.بعدا بـه تمـامی گـوده هـا 25 میکرولیتـر محلـول آنتـی ژن استاندارد ( 4 واحـد (HA افـزوده گردیـد.پس از ایـن مرحلـه درپوش پلیت گذاشته و به مدت 30 دقیقـه در دمـای اتـاق œC)
25 تا (22 نگهداری شد که بعد از این زمان به تمامی گوده هـا 50 میکرولیتر سوسپانسیون آماده شده گلبول قرمز اسـب اضـافه شد و پس از 30 دقیقه قرار دادن پلیت در دمای اتاق، نسبت بـه
قرائت نتایج آن اقدام گردید(14،.(13
آنالیز آماری
دادههای جمع آوری شده از گـروههـای مختلـف بـا اسـتفاده از
نرمافـزار SPSS و آزمـون Chi-square بـا هـم مقایسـه شـدند.
جهت تجزیه و تحلیل آماری عیار HI بـین گـروههـای بیمـار از
آزمــون T-Test و گــروه هــای ســالم از آزمــون ANOVA و Tukeyʼ Test استفاده گردید.سطح معنیداری در این آزمـونهـا 0/05 در نظر گرفته شد.
نتایج
عیار آنتـی بـادی هـای ضـد ویـروس آنفلـوانزای مرغـی تحـت
تیپH9N2 در نمونه های سرم اخذ شده از گـروه هـای مختلـف جمعیت انسانی شامل بیمـاران بـا عـوارض تنفسـی بسـتری در بیمارستان، بیماران بدون عوارض تنفسی بسـتری در بیمارسـتان،
پرسـنل بهداشـتی شـاغل در بیمارسـتان و مرغـداران وکــارگران
مرغداریهـا و کشـتارگاههـای طیـور و همچنـین دامپزشـکان و واکسیناتورها توسط تست HI سنجیده شد. نمونه های کـه دارای
عیــار HI مســاوی و بــالاتر از 1/20داشــتند بــه عنــوان حضــور
معنیدار آنتی بادی و واکنش مثبت سرمی در نظر گرفته شـدند.
نتایج حاصله در جداول 1،4 2،3 نشان داده شده است.
جدول -1-1 مقایسه موارد مثبت سرمی و عیار تست HI در گروه های بیمار و سالم
گروهها تعداد تعداد واکنش درصد مثبت درصد مثبت سرمی از درصد مثبت سرمی از خطای معیار ک ت ب ت
نمونه مثبت سرمی سرمی در هرگروه کل نمونههای مثبت کل نمونه اخذ شده میانگین
بیماران 174 53 30/5 65/4 17 10/38 21/88 1/20 1/80
سالم 137 28 20/4 34/5 9 10/47 22/03 1/20 1/40
جمع 311 81 26 100 26 - - -
621
آیدین عزیزپور، سعید بکائی، نریمان شیخی، شهرام حبیبزاده
ک ت: کمترین تیتر ب ت: بیشترین تیتر
از مجموع 311 نمونه سرم خون انسانی جمعآوری شده،174 تیتر به ترتیب مربوط به گروههای سالم و بیمار به دست آمد.
نمونه مربوط به گروه بیماران و 137 نمونه مربوط به گروه هرچند که رابطه آماری معنیداری بین این دو گروه وجو
سالمها بودند. گروههای بیمار و سالم به ترتیب 30/5 و 20/4 نداشت(.( p>0/05 در هر دو گروه مورد بررسی کمترین میزان
درصد واکنش سرمی مثبت در آزمایشHI نشان دادندکه از عیار 1/20 و بیشترین میزان آن به ترتیب در گروههای بیمار و
لحاظ آماری معنیدار بود .( p<0/05) با توجه به توزیع سالم 1/80 و 1/40 مشاهده گردید (جدول .(1-1
آمارههای مربوط به عیار HI بیشترین و کمترین میزان میانگین
جدول -2-1 مقایسه موارد مثبت سرمی و عیار تست HI در گروه های بیمار
گروهها تعداد تعداد واکنش درصد مثبت سرمی درصد مثبت سرمی از درصد مثبت سرمی از خطای معیار ک ت ب ت
نمونه مثبت سرمی در هر گروه کل نمونههای مثبت کل نمونه اخذ شده میانگین
RD 86 32 37/2 60/4 18/4 10/74 /03 1/20 1/40
22
NRD 88 21 23/9 39/6 12/1 10/41 /88 1/20 1/80
21
جمع کل 174 53 30/5 100 30/5 - - -
: RD بیماران با عوارض تنفسی : NRD بیماران بدون عوارض تنفسی
آنالیز آماری نشان میدهد بین عوارض تنفسی بیماران با حضور عوارض تنفسی بیشترین میزان میانگین عیار HI مشاهده گردید،
معنی دار آنتی بادی، ارتباط مثبت و معنی داری وجود دارد هر چند که این اختلاف از لحاظ آماری معنی دار نبود(0/05
.(p<0/05)یعنی در این تحقیق می توان گفت که هرچه افراد .(p> در هر دو گروه بیماران کمترین میزان عیار 1/20 و
مشکلات تنفسی داشته باشند،احتمال بروز بیماری بیشتر می بیشترین میزان آن به ترتیب در بیماران بدون عوارض تنفسی و
شود. در بیماران با عوارض تنفسی در مقایسه با بیماران بدون با عوارض تنفسی 1/80 و 1/40 به دست آمد ( جدول .(2-1
جدول 3-1ـ مقایسه موارد مثبت سرمی و عیار تست HI در گروههای سالم
گروهها تعداد نمونه تعداد واکنش درصد مثبت سرمی درصد مثبت سرمی از درصد مثبت سرمی از خطای معیار ک ت ب ت
مثبت سرمی در هر گروه کل نمونههای مثبت کل نمونه اخذ شده میانگین
VET 41 12 29/3 42/8 8/8 /14 10 /59 /20 1/40
21 1
PH 44 8 18/2 28/6 5/8 /00 10 /00 /20 1/20
20 1
PW 52 8 15/4 28/6 5/8 /02 11 /35 /20 1/40
26 1
جمع کل 137 28 - 100 20/4 - - -
622
بررسی حضور آنتیبادیهای سرمی ضد ویروس آنفلوانزای مرغی تحت تیپ H9N2 در جمعیت انسانی منطقه اردبیل
: VET دامپزشکان و واکسیناتورها PH :پرسنل بهداشتی بیمارستان PW :مرغداران وکارگران مرغداریها
با توجه به جدول 3-1 توزیع فراوانی واکنش مثبـت سـرمی کارگران مرغداریها و پرسنل بهداشتی بیمارسـتان مشـاهده
در گروه دامپزشکان و واکسـیناتورها 29/3 درصـد، پرسـنل گردیــد، امــا ایــن اخــتلاف از لحــاظ آمــاری معنــیدار نبــود
بهداشـتی بیمارســتان 18/2 درصـد و مرغــداران و کــارگران (p>0/05) در گروههای سالم کمترین میـزان عیـار 1/20 و
مرغداریها و کشتارگاههای طیور 15/4 درصد تعیـین گردیـد بیشترین میـزان آن بـه ترتیـب در گـروههـای دامپزشـکان و
کــه از لحــاظ آمــاری دارای اخــتلاف معنــیداری نیســتند واکســیناتورها،مرغداران وکــارگران مرغــداریها و پرســنل
.(p>0/05) با توجه به تجزیـه و تحلیـل آمـاری بیشـترین و بهداشتی بیمارستان 1/40، 1/40 و 1/20 بود.
کمترین میانگین عیار HI به ترتیب در گروههای مرغـداران و
جدول .1-2 مقایسه وضعیت تیترهای مثبت سرمی در بین 4 رده سنی گروه های بیمار و سالم.
تعداد و درصد موارد تعداد و درصد موارد تعداد و درصد موارد تعداد و درصد موارد
گروهها مثبت سرمی در گروه مثبت سرمی در گروه مثبت سرمی در گروه مثبت سرمی در گروه
سنی زیر 30 سال سنی45- 31 سال سنی 60-46 سال سنی بالای 60 سال
بیماران (%38/9)7 (%40/7)11 (%24)12 (%29/1)23
سالم (%23/8)19 (%16/3)8 (%12/5)1 -
جمع (%26/5)26 (%25)19 (%22/4)13 (%29/1)23
جدول .2-2 مقایسه وضعیت تیترهای مثبت سرمی در بین 4 رده سنی گروه های بیمار.
تعداد و درصد تعداد و درصد تعداد و درصد تعداد و درصد
گروهها موارد مثبت سرمی موارد مثبت سرمی موارد مثبت سرمی موارد مثبت سرمی
در گروه سنی زیر در گروه سنی در گروه سنی در گروه سنی
30 سال 45-31 سال 60-46 سال بالای 60 سال
بیماران با عوارض تنفسی (%66/7)4 (% 33) 3 (%33/3)8 (%36/2)17
بیماران بدون عوارض تنفسی (%25)3 (%44/4)8 (%15/4)4 (%18/8)6
جمع (%38/9)7 (%40/7)11 (%24)12 (%29/1)23
ارتباط بین سنین مختلف با حضور معنیدار آنتی بادی در البته لازم بذکر است که در گروه سنی 45-31 سال بین دو
گروه های حاضر مورد بررسی قرار گرفت . بطوریکه در هر گروه بیمار و سالم اختلاف معنی دار مشاهده گردید
دو گروه کمترین میزان واکنش مثبت سرمی درگروه سنی (p<0/05) درحالیکه در سایر گروه های سنی تفاوت معنی
60-46 و بیشترین میزان آن در گروه های بیمار و سالم به دار وجود نداشت( جدول .(1-2
ترتیب گروه های سنی 45-31 و زیر 30 سال بوده است.
623
آیدین عزیزپور، سعید بکائی، نریمان شیخی، شهرام حبیبزاده
در بیماران با عوارض تنفسی کمترین میزان حضور معنی دار میزان آن در گروه سنی 60-46 سال((%15/4 بدست آمد،
آنتی بادی در گروه سنی (%33) 45-31 و بیشترین میزان با توجه به تجزیه و تحلیلی آماری بین گروه های بیمار در
آن در گروه سنی زیر 30 سال((%66/7 مشاهده گردید. در چهار رده سنی تفاوت معنی دار مشاهده نگردید()(p>0/05
حالیکه در بیماران بدون عوارض تنفسی بیشترین میزان جدول .(2-2
واکنش سرمی در گروه سنی 45-31 (%44/4) و کمترین
جدول -3-2 مقایسه وضعیت تیترهای مثبت سرمی در بین 3رده سنی گروههای سالم
گروهها تعداد و درصد موارد مثبت سرمی تعداد و درصد موارد مثبت سرمی تعداد و درصد موارد مثبت سرمی
در گروه سنی زیر 30 سال در گروه سنی 45-31 سال در گروه سنی 60-46 سال
دامپزشکان و واکسیناتورها (%42/1)8 (% 19) 4 -
پرسنل بهداشتی بیمارستان (%19/4)6 (%16/7)2 -
مرغداران وکارگران مرغداریها (%16/7)5 (%12/5)2 (%16/7)1
جمع کل (%23/8)19 (%16/3)8 (%12/5)1
با توجه به جدول 3-2 در گروه های مرتبط و غیر مرتبط با در گروه های سالم، میزان واکنش مثبت سرمی کاهش
صنعت طیور بیشترین میزان حضور معنیدار آنتیبادی در مییابد، هرچند که از لحاظ آماری معنیدار
گروه سنی زیر 30 و کمترین میزان آن در گروه سنی -46 نیستند(.(p>0/05
60 سال بوده است.به عبارت دیگر به موازات افزایش سن
جدول -1-3 مقایسه موارد مثبت سرمی در گروه های بیمار و سالم بر اساس جنس.
گروهها تعداد نمونه تعداد واکنش درصد موارد مثبت درصد واکنش مثبت سرمی از درصدمثبت سرمی از
مثبت سرمی سرمی در هر گروه نمونههای مثبت براساس جنس کل نمونه اخذ شده
بیمار مرد 108 35 32/4 58/3 11/2
سالم مرد 114 25 21/9 41/7 8
بیمار زن 66 18 27/3 85/7 5/8
سالم زن 23 3 13 14/3 1
جمع مرد 222 60 27 - 19/3
جمع زن 89 21 23/6 - 6/7
جمع کل 311 81 - - 26
رابطه بین جنس و میزان واکنش مثبت سرمی در گروههای مرد و کمترین توزیع فراوانی آن در جنس زن وجو دارد.
مورد بررسی در جدول 1-3 نشان داده شده است.تجزیه و هرچند که رابطه آماری معنیداری بین دو گروه بیمار و سالم
تحلیل آماری نشان میدهد که در هر دو گروه بیمار و سالم از لحاظ جنس مرد و زن مشاهده نشد .( p>0/05)
بیشترین توزیع فراوانی حضور معنیدار آنتی بادی در جنس
جدول -2-3 مقایسه موارد مثبت سرمی در گروه های بیمار بر اساس جنس
