بخشی از مقاله
خلاصه
به منظور تفکیک نژادهای ویروس Y سیب زمینی با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی در آزمون RT-PCR ، عصاره گیاهان آلوده در شرایط گلخانه به گیاه Nicotiana tobacum cv. Samsun N. مایه زنی شدند. پس از تکثیر این ویروس، RNA آل گیاهان آلوده با استفاده ازکیت استخراج و آزمون RT- PCR با استفاده از آغازگرهاي RM/FM منجر به تکثیر قطعه اي از ژن P1 به طولbp 490 براي تمامی نژادهاي ویروس Y گردید. جهت تمایز نژادهاي PVYNTN وPVYN از سایر نژادهای ویروس از جفت آغازگر FM-1/RN استفاده شد آه منجر به تکثیر طول آامل ژن P1 به طولbp 838 گردید.
جهت تمایزPVYNTN و PVYN از آغازگر هاي اختصاصی PV3TIM /PVNIBIP استفاده گردید، که قطعه اي از ژن CP به طول1224 bp مربوط به نژاد PVYNTN را همانند سازی نمود. علاوه بر این جهت تمایز نژادهای PVYO وPVYC نیز از آغازگر هاي S7/ AR استفاده گردید آه قادر به تکثیر قطعه اي به طول283 bp از ژن P1 مربوط به جدایه PVYO می باشد. از طرف دیگر براي شناسائی نژادPVYC از جفت آغازگرهاي C-8687F/O9295R استفاده گردید که قطعه اي به طول 609 bp را تکثیر نمود.
مقدمه
اولین گزارش از وقوع بیماري ویروسY سیب زمینی درسال 1931 توسط Smith می باشد. این بیماري مربوط به نژاد رایج ویروس Y سیب زمینی - PVYO - بوده که در اکثر مناطق کاشت سیب زمینی یافت می شود . - 6 - دردهه 1950یک نژاد جدید از ویروس Y سیب زمینی - PVYN - که علایم نکروزآوندي توتون را ایجاد می کرد در اروپا و جنوب آمریکا شناسایی وسپس درسراسر دنیا پراکنده شده است. در حال حاضر این نژاد ازنیوزلند، آفریقا و شمال آمریکا گزارش شده است. پس از آن که دو ویروس گیاهی با ژنوم RNA ، یکی مربوط به ویروسY سیب زمینی ودیگري مربوط به ویروس C سیب زمینی راشناسایی گردید، بعد از آن مشخص شد که RNA دوم مربوط به نژادي ازویروس Y سیب زمینی تحت نام نژاد PVY C می باشد.
نژادC این ویروس ازشرق استرالیا، نیوزلند، اروپا، آفریقا و جنوب آمریکا گزارش شده است. اخیراً نژاد جدیدي ازویروس Y سیب زمینی به نام نژاد NTN گزارش شده است. اولین گزارش ازوقوع این نژاد توسط Becnzer و همکاران در سال 1982 ازمنطقه مجارستان می باشد - . - 1 کاهش محصول سیب زمینی براثرآلودگی توسط نژادهاي PVY بین 40 تا 70 درصد می باشد. براثرآلودگی به PVYN کاهش محصول گاهی اوقات به 100 درصد می رسد. درمزارع توتون آلوده به PVY نیز میزان کاهش محصول بین 14 تا 59 درصد می باشد . - 5 -
مواد و روشها
در این تحقیق ابتدا PVY در نمونه های جمع آوری شده سیب زمینی با استفاده از آزمون الیزای غیر مستقیم - indirect-ELISA - تشخیص داده شد. سپس از آزمون الیزاي مستقیم ترکیبی با استفاده از آنتی بادیهاي تک همسانه اي اختصاصی نژادهاي ویروس Y سیب زمینی - تهیه شده ازشرآت Agdia هندوستان - جهت تفکیک نژادها استفاده گردید. تفکیک مولکولی نژاد PVYN با استفاده از از آغازگرهای اختصاصی نژاد FM1/RN صورت گرفت که جهت تکثیر ترادف حفاظت شده ژن پروتئاز - - P1 استفاده گردید. آغازگرهاي S7/AR که مبتنی بر توالی های ناحیه ژن P1 می باشند جهت شناسائی نژادO این ویروس استفاده شد، در آزمون PCR استفاده گردیدند . - 3 -
در این ناحیه ژنی بیشترین میزان تنوع در بین نژادهاي PVY وجود دارد. آغازگرهاي دیگر شامل O9295R وC-8687F می باشد که قادر به شناسایی نژاد PVYC بودند . - 2 - علاوه بر این آغازگرهاي اختصاصی دیگري به نام PVNIBIP/PVY3TIM به منظور شناسایی نژادPVYNTN نیز استفاده گردید. آغازگرهاي مذکور ناحیه کدکننده پروتئین پوششی را در نژادهاي مختلف PVY تکثیر میکنند - . - 4 مشخصات آغازگرهاي مورد استفاده در جدول 1 منعکس شده است.
چرخه هاي آزمون PCR شامل سه مرحله وا سرشت سازي، اتصال، و گسترش نهایی می باشد که جهت آغازکرهای S7/AR، FM1/RN، C-8687F /O9295R و PVNIBIP/PVY3TIM واسرشته سازی اولیه سه دقیقه در 94 درجه سانتیگراد انجام گرفت، واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای S7/AR در 30 سیکل شامل مرحله واسرشت 30 ثانیه در دمای 92 درجه سانتیگراد، اتصال 30 ثانیه در دماي 60 درجه سانتیگراد، بسط 90 ثانیه و گسترش نهایی 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد بود. این واکنش برای آغازگرهای FM1/RNدر 35 سیکل شامل مرحله واسرشت 30 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال 30 ثانیه در دماي 58 درجه سانتیگراد، بسط 90 ثانیه و گسترش نهایی 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد بود.
آغازگرهای C-8687F /O9295R در برنامه ای با30 سیکل شامل مرحله واسرشت 60 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال 60 ثانیه در دماي 58 درجه سانتیگراد، بسط 60 ثانیه و گسترش نهایی 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد مورد استفاده قرار گرفتند. در نهایت آغازگرهای PVNIBIP/PVY3TIM در یک برنامه با 35 سیکل شامل مرحله واسرشت 30 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال 30 ثانیه در دماي 62 درجه سانتیگراد و بسط 90 ثانیه و گسترش نهایی 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد استفاده شدند.
نتایج و بحث
استخراج Total RNA به روش کیت High pure viral nucleic acid kit - Roch, Germany - صورت گرفت. با استفاده از آر. ان. ای استخراج شده و آغازگرهاي معکوس اختصاصی برای هر نژاد cDNA ساخته شد - جدول . - 1 جدایه هایی از PVY که در آزمون الیزاي مستقیم ترکیبی به نژادهای PVYC، PVYO و PVYN آلوده بودند، تحت تاثیر آغازگر هاي اختصاصی هر نژاد قرار گرفتند. آغازگرهاي انتخابی مربوط به ژن P1 شامل FM-1/RN و S7/AR بودند که برای تفکیک نژادهای PVYN وPVYO مورد استفاده گرفتند و به ترتیب دو قطعه 838 و 283 را تکثیر نمودند.
آزمون RT-PCR برای تشخیص نژاد PVYC با استفاده ازآغازگر O-9295R/ C-8687F منجر به تشکیل باندي به طول 609 جفت باز گردید. جدایه هایی از PVY با آمک آغازگرهاي اختصاصی نژاد PVYN باندهاي موردنظر را تشکیل داده بودند، مجددا در آزمون PCR با آمک آغازگرهاي PVY3TIM/PVNIBIP که اختصاصی نژاد PVYNTN بود، مورد استفاده قرار گرفتند. محصول به دست آمده از PCR منجر به تکثیر قطعه اي به طول 1224 جفت باز گردید - شکل . - 1 عده اي از محققین معتقدند که نژاد PVYNTN نتیجه تغییر یا نوترکیبی ژنتیکی در ژنوم نژاد PVYN می باشد، به همین جهت این نژاد از طریق روش هاي سرولوژیکی قابل جداشدن از نژاد PVYN نمی باشد و تنها از طریق روش هاي مولکولی و بکارگیري آغازگرهاي اختصاصی و واکنش بر روي گیاهان محک خاص از نژاد PVYN قابل تفکیک می باشد . - 5 -
