بخشی از مقاله
چکیده
به منظور ردیابی سرولوژیکی و مولکولی مهمترین ویروس درختان میوه هسته داران ، نمونه برداري طی فصول مختلف سال 1385ازدرختان آلو، هلو، شلیل، گیلاس و زردآلو باغات استان گلستان صورت گرفته وبا کمک آنتی سرم پلی کلونال پنج ویروس مهم هسته داران Plum Pox Potyvirus - PPV - , Prunus Necrotic Ring Spot Ilarvirus - PNRSV - ,Arabis Mosaic Potyvirus - ArMV - ,Prunus Dwarf Ilarvirus - PDV - ,CLRV - Cherry Leaf Roll Virus - با روش DAS- ELISA و واکنش زنجیره اي پلی مرازتست شدند. از بین پنج یروس فوق الذکر تنها ویروس PNRSV از میزبان هاي هلو ، آلو و شلیل در تست الیزا واکنش مثبت داشته اما در نمونه هاي گیلاس و زردآلو هیچگونه آلودگی مشاهده نشد.
همچنین نتایج ارزیابی میزان آلودگی 17 رقم از ارقام مختلف هسته داران در بیست تکرار به PNRSVدر تست هاي سرولوژیک وتجزیه واریانس با آزمون دانکن نشان داد بیشترین درصد آلودگی مربوط به هلو - - %15/5 و کمترین مربوط به آلو - - %1/32 بوده است.از بین ارقام مختلف آلو بیشترین آلودگی مربوط به آلوشابلون دیررس - - %3/2 و کمترین آن مربوط به آلو بخارا - %0/8 - بوده است. از بین ارقام شلیل کمترین آلودگی مربوط به رقم مغان - - %0/57 و بیشترین آن مربوط به رقم ردگلد - - %3/75 بوده است.
از بین ارقام مختلف هلو، بیشترین آلودگی - - %15/5 مربوط به هلوشصت روزه و کمترین آلودگی مربوط به هلو انجیري بوده است. همچنین نتایج تست هاي سرولوژیک پراکنش آلودگی PNRSVدر استان نشان داد علی آباد و گنبد با بیشترین میزان آلودگی - - %15/5و کردکوي و آزادشهر، داراي کمترین میزان آلودگی - - %1/1 به ویروس PNRSV هستند. همچنین نتایج بررسی هاي مولکولی ، پس از استخراج RNA ژنومی و تکثیر cDNA با جفت پرایمرهاي عمومی و اختصاصی - NAS1 وNAS2 ، طراحی شده از ژنوم ناحیه - cp به روش RT-PCR و پس از الکتروفورز بر روي ژل آگارز ، با ند ي در محدوده 356 جفت باز مربوط به PNRSV بدست آمد.
مقدمه
درختان میوه هستهدار متعلق به تیره Rosaceae، و جنس Prunus شامل هلو، شلیل، آلو، زردآلو، گوجه، گیلاس و بادام و غیره هستند .بیماري ویروسی لکه حلقوي نکروتیک درختان میوه یکی از مهمترین بیماري هاي اقتصادي درختان میوه هستهدار است، که روي هلو باعث کاهش عملکرد به میزان20 تا %22 و کاهش رشد، تغییر رنگ میوه، تاخیر در بلوغ و رسیدگی میوه می شود . این ویروس اولین بار در سال 1941 روي هلو گزارش شد و داراي گسترش جهانی بوده و تقریبا در تمام مناطق کشت درختان میوه هسته دار وجود دارد - سالم و همکاران، . - 2004اولین گزارش از وجود PNRSV در ایران به سال 1379 برمی گردد که توسط معینی و ایزد پناه از استان اردبیلبوده است.
این ویروس که به اختصار PNRSV خوانده میشود، از خانواده Bromoviroidae و جنس Ilarvirus است .تمام اعضاء این گروه داراي ژنوم RNA تک رشتهاي سه بخشی هستند که هر کدام درون ذرات ایزومتریک جداگانهاي به قطر 26 تا 35 نانومتر قرار دارند. دامنه میزبانی PNRSV خانوادههاي Amarantaceae، Apiaceae، Canabinaceae، Chenopodiaceae، Cucurbitaceae، Asteraceae، Fabaceaea، Malvaceae، Rosaceae، Scrophalariaceae، Solonaceae به این ویروس حساس هستند - فرزادفر و همکاران، . - 1382 این ویروس از طریق مکانیکی و پیوند قابل انتقال است ولی بیشترین انتقال در طبیعت از طریق پیوند و دانه گرده - - %70 صورت میگیرد.
روش تحقیق
جهت انجام تست الایزا و به منظور ردیابی و تشخیص ویروسهاي بیماريزاي درختان میوه هستهدار طی سال زراعی 1385، از باغات درختان میوه علیآباد، فاضلآباد، گنبد، آزادشهر، مینودشت، گرگان، کردکوي و بندرگز ، تعداد 800 نمونه مرکب گرفته شد پس از جمعآوري، به منظور تعیین حضور یا عدم حضور ویروس در نمونهها، آزمون داس الایزا با آنتیسرمهاي پلیکلونال پنج ویروس Prunus Necrotic Ring Spot Ilarvirus Plum Pox Potyvirus ،Arabis Mosaic Potyvirus، Prune Dwarf Ilarvirus، Cherry Leaf Roll Nepovirus ، انجام شد.1 براي تعیین میزان آلودگی به ویروس از روش داس الایزا بر پایه روش کلارك و آدامز - 1977 - استفاده شد.
نمونهبرداري جهت آمادهسازي عصارهها براي تست PCR وعصارهگیري به روش سانچزناوارو و همکاران - 1998 - و روش ترایزول - براي تهیه بافر ها از روش ویلکنینگ وهمکارن - 2004 - استفاده شد. براي تعیین غلظت ژنوم استخراج شده، تعیین جذب نوري در طول موجهاي 260، 270، 280 و نسبت260/280 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر - به روش سالم وهمکاران، . - 2004انجام گرفت و غلظتهاي مناسب براي PCR انتخاب شدند.
PCR به همراه نسخهبرداري معکوس - RT-PCR - از آنجاییکه ژنوم ویروس هاي مذکور از نوع RNA می باشد، ابتدا RNA را با روش کاملاً شناخته شده نسخه برداري معکوس که در حالت طبیعی توسط ویروس هاي RNA دار، براي تبدیل RNA ژنومی آنها به DNA در داخل سلول میزبان به کار می رود، تبدیل به DNA کرده و سپس تکثیر PCR بر روي cDNAهايDNA - 2هاي مکمل - به دست آمده انجام گردید.
