بخشی از مقاله
چکیده:
ویروس موزاییک زرد لوبیا - Bean yellow mosaic virus-BYMV - یکی از مهمترین ویروسهاي بیماريزا در گیاهان از جمله گیاهان لگومینه محسوب میگردد. این ویروس با پیکرههاي رشتهاي شکل بطول 750 تا 950 نانومتر عضو جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae میباشد. طی سالهاي 1389 و 1390 تعداد 135 نمونه شبدر - Trifolium sp. - با علائم بدشکلی، زردي برگ، کوتولگی، پیسک و ابلقی بهمراه تعداد 436 نمونه تصادفی از استان گیلان جمعآوري گردید. این نمونهها از نظر آلودگی به ویروس BYMV با استفاده از آنتیبادي اختصاصی و به روش DAS-ELISA مورد آزمون قرار گرفتند . تعدادي از نمونههاي مثبت در آزمون الایزا انتخاب شده و روي گیاهان محک مایهزنی مکانیکی شدند.
همچنین آلودگی تعدادي از نمونهها به ویروس BYMV با استفاده از روش واکنش زنجیرهاي پلیمراز و آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده براي ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس، مورد بررسی قرار گرفت. حدود سه تا پنج روز پس از مایهزنی، علائم لکههاي موضعی با حاشیه قرمز در و و حدود دو هفته بعد علائم سیستمیک شدن ویروس در گیاهان P. vulgaris و Vicia faba ظاهر گردید. بر اساس نتایج آزمون الایزا درصد آلودگی به ویروس BYMV در نمونههاي علائمدار و تصادفی بترتیب برابر با 27/4 و 13/3 درصد بود. نتایج حاصل از بررسی محصول پی.سی.آر نشاندهنده تکثیر قطعه دي.ان.اي بطول حدود 900 جفت باز بود که با طول قطعه مورد انتظار مطابقت داشت.
همچنین بکمک روش پی .سی.آر آلودگی تعدادي از نمونههاي شبدر به BYMV که در آزمون الایزا فاقد واکنش مثبت بودند، تایید گردید. بر اساس نتایج بررسیهاي بیولوژیکی، الایزا و آزمون پی.سی.آر آلودگی نمونههاي شبدر به ویروس BYMV مورد تایید قرار گرفت. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی BYMV در گیاه شبدر از کشور بوده و میزبان شبدر براي این ویروس از استان گیلان براي اولین بار در کشور در این تحقیق گزارش میگردد.
مقدمه:
ویروس موزاییک زرد لوبیا - Bean yellow mosaic virus-BYMV - عضو جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae میباشد. این ویروس داراي پیکرههاي میلهاي شکل به طول 750 تا 950 نانومتر است. ژنوم آن متشکل از آر.ان.اي تک رشتهاي با دنباله PolyA بوده و ترجمه آن منجر به تشکیل یک پلیپروتئین بزرگ میگردد. این ویروس قادر به ایجاد بیماري در دامنه گستردهاي از گیاهان لگوم زراعی و باغی بوده و آلودگی طبیعی به آن در برخی از تک لپهايها، ثعلبها و چندین نوع درخت غیر مثمر نیز گزارش شده است.
این ویروس توسط 50 گونه شته به طریق ناپایا منتقل شده و انتقال آن از طریق بذر و به روش مکانیکی نیز گزارش شده است - 3 و . - 4 حدود 200 گونه در 14 خانواده گیاهی نسبت به آلودگی به این ویروس حساس گزارش شدهاند - . - 2 لگومهاي علوفه اي از جمله شبدر - Trifolium sp. - از جمله گیاهان حساس به این ویروس بوده و شیوع این ویروس در این مزارع موجب کاهش چشمگیر رشد و خسارت اقتصادي میگردد - 4 و . - 6 تشخیص و ردیابی این عوامل بیمارگر ویروسی در شناسایی مناطق آلوده، تعیین پراکنش ویروس و نهایتا در مدیریت و کنترل خسارت ناشی از آنها از اهمیت زیادي برخوردار است.
در سالهاي 1389 و 1390 تعدادي بوته شبدر با علائم بدشکلی، زردي، ابلقی و کاهش رشد در مزارع استان گیلان مشاهده و جمعآوري گردید. در این تحقیق آلودگی این نمونهها به ویروس BYMV با استفاده از روشهاي آزمون سرولوژیکی الایزا و نیز روش مولکولی واکنش زنجیره اي پلیمراز بررسی و تایید گردید. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی ویروس BYMY در مزارع شبدر استان گیلان میباشد.
مواد و روشها:
طی سالهاي 1389 و 1390 مجموعا تعداد 135 نمونه شبدر با علائم برگی بدشکلی، چین خوردگی، لکه هاي نکروتیک، پیسک، ابلقی، زردي و کاهش رشد همراه با تعداد 436 نمونه تصادفی از مزارع شبدر استان گیلان جمعآوري گردید. این نمونهها از نظر آلودگی به ویروس BYMV به روش آزمون سرولوژیکی DAS-ELISA و بکمک آنتیبادي اختصاصی - شرکت بیوربا سوئیس - مورد ارزیابی قرار گرفتند - . - 5 بشقابکهاي الایزا از نوع گرینر - آلمان - بوده وحجم واکنشها در هر چاهک 100 میکرولیتر انتخاب شد. نمونههاي برگی در بافر تریس 0/1 مولار با اسیدیته 8/2 و به نسبت 1 گرم بافت در 10 میلیلیتر بافر، عصارهگیري شدند.
نتایج واکنشها یک ساعت بعد از افزودن بافر سوبسترا، توسط دستگاه الایزا ریدر مدل مولتی اسکن، ساخت کارخانه لب سیستم فنلاند در طول موج 405 نانومتر خوانده شد. نمونههایی که میزان جذب نوري چاهک مربوط برابر یا بزرگتر از سه برابر میانگین جذب مربوط به شاهد سالم بود، بعنوان نمونههاي با واکنش مثبت - آلوده - در نظر گرفته شدند. نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند پس از عصارهگیري در بافر فسفات 0/1 مولار - اسیدیته - 7/4 روي تعدادي گیاه محک مایهزنی مکانیکی شدند.
همچنین حضور ویروس BYMVدر تعدادي از این نمونهها و نیز تعدادي از نمونههاي علائمدار فاقد واکنش مثبت در آزمون الایزا، با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز به روش رونوشت برداري برگردان - RT-PCR - مورد بررسی قرار گرفت. در این مرحله آر.ان.اي کل نمونههاي برگی استخراج گردیده و واکنش RT-PCR بصورت دو مرحلهاي و با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ناحیه ژن پروتئین پوششی BYMV انجام شد - . - 1 بطور خلاصه محصول واکنش بر روي ژل آگارز %1 الکتروفورز شده و مورد مشاهده قرارگرفت. بعنوان شاهد سالم از گیاهان شبدر پرورش یافته در گلخانه عاري از حشرات ناقل استفاده گردید.
نتایج:
نتایج حاصل از آزمون الایزا، نشان داد که از تعداد 135 و 436 نمونه شبدر بترتیب علائمدار و تصادفی، تعداد - %27/4 - 37 و 58 - %13/3 - به ویروس BYMV آلوده بودند. مهمترین علائم همراه با نمونههاي شبدر داراي واکنش مثبت در آزمون الایزا، شامل موزائیک و بدشکلی شدید برگها بود. مایهزنی عصاره نمونههاي با واکنش مثبت در آزمون الایزا روي گیاهان محک، منجر به ظهور علائم لکههاي موضعی با حاشیه قرمز در Chenopodium amaranticolor و Phaseolus vulgaris و حدود دو هفته بعد علائم سیستمیک موزائیک خفیف و پیسک در گیاهان P. vulgaris و باقلا - Vicia faba - گردید که با خصوصیات توصیف شده در مورد ویروس BYMV مطابقت داشت - 3 و . - 4 سیستمیک شدن ویروس در این گیاهان با استفاده از آزمون الایزا مورد بررسی و تایید قرارگرفت.
نتایج حاصل از بررسی محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز نشان دهنده تکثیر قطعه دي.ان.اي بطول حدود 900 جفت باز بود که با اندازه مورد انتظار مطابقت داشته و در شاهد سالم چنین قطعهاي ساخته نشده بود - . - 7 همچنین در مورد تعداد دو عدد از نمونههاي علائمدار که در آزمون الایزا واکنش مثبت قابل توجه و معنیداري نداشتند، ویروس BYMV با استفاده از واکنش زنجیره اي پلیمراز ردیابی گردید که نشاندهنده دقت بالاتر تکنیک پی .سی.آر نسبت به روش الایزا در ردیابی ویروس BYMV در گیاه شبدر است. مجموع نتایج حاصل از بررسیهاي بیولوژیکی، الایزا و واکنش زنجیرهاي پلیمراز نشان دهنده آلودگی نمونههاي شبدر مورد بررسی به ویروس BYMV است. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی ویروس BYMV از گیاه شبدر در استان گیلان می باشد.
تشکر و قدردانی:
از موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور و گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزي دانشگاه گیلان بخاطر تامین امکانات و هزینههاي اجراي این تحقیق تشکر و قدردانی می گردد.
