بخشی از مقاله
چکیده:
ویروس موزائیک خیار - Cucumber mosaic virus - CMV از مهمترین ویروسهاي بیمارگر در گیاهان محسوب می شود. این ویروس با پیکره هاي ایزومتریک به قطر 28 نانومتر عضو جنس Cucumovirus از خانواده Bromoviridae میباشد. در سال 1388، تعداد 17 نمونه گیاه کرفس وحشی - Apium graveolens - با علائم موزائیک و پیسک همراه با بدشکلی برگها و کاهش رشد در حاشیه برخی مزارع استان لرستان مشاهده و جمعآوري گردید. این نمونهها از نظر آلودگی به ویروسهاي Alfalfa mosaic virus-AlMV، Arabis mosaic virus-ArMV، Cucumber mosaic virus-CMV، Tomato ring spot virus-ToRSV و Tomato spotted wilt virus-TSWV به روش سرولوژیکی DAS-ELISA مورد آزمون قرار گرفتند.
نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند، انتخاب شده و روي گیاهان محک مایهزنی مکانیکی شدند. همچنین آر.ان.اي کل این نمونهها استخراج شده و حضور ویروس CMV در آنها با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی - طراحی شده براي ناحیه ژن - CP طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز بروش رونوشتبرداري برگردان - آر.تی-پی.سی.آر - مورد ارزیابی قرار گرفت. تعداد 12 نمونه با آنتیبادي اختصاصی ویروس CMV واکنش مثبت داشتند.
چهار تا پنج روز پس از مایهزنی نمونههاي مثبت در آزمون الایزا، علائم لکههاي موضعی نکروزه در گیاهان لوبیا چشم بلبلی - Vigna unguiculata - و سلمه تره - Chenopodium quinoa - ظاهر شده و حدود 10 روز بعد در گیاهان N. tabacum cv. samsun و N. glutinosa علائم موزائیک و بدشکلی برگها ظاهر شده و سیستمیک شدن ویروس در آنها از طریق آزمون الایزا بررسی و تایید گردید.
این علائم با خصوصیات توصیف شده در مورد ویروس CMV مطابقت دارد. نتایج حاصل از الکتروفورز محصول واکنش زنجیره اي پلیمراز در ژل آگارز نشاندهنده تکثیر قطعهاي باندازه حدود 940 جفت باز بود که با اندازه مورد انتظار مطابقت داشت. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی و سرولوژیکی ویروس CMV از روي گیاه کرفس وحشی از ایران میباشد. شناسایی میزبانهاي طبیعی ویروسها، در مدیریت کنترل بیماریهاي ناشی از آنها اهمیت زیادي دارد.
مقدمه:
ویروس موزائیک خیار - CMV - عضو جنس Cucumovirus از خانواده Bromovirida می باشد که دامنه میزبانی بسیار وسیعی در گیاهان زراعی، باغی و غیرمثمره دارد - . - 5 این یروس داراي پیکره ایزومتریک به قطر 28 تا 30 نانومتر بوده و ژنوم آن شامل سه قطعه RNA تک رشته اي مثبت خطی می باشد. این ویروس به آسانی به روش مایهزنی مکانیکی منتقل شده و نیز بیش از 80 گونه شته از خانواده Aphididae شناخته شده اند که این ویروس را به طریق ناپایا منتقل میکنند - . - 4 انتقال این ویروس توسط بذر در برخی گونه هاي گیاهی مانند Cucurbita.moschata، C. mixta، C. manima، C. pepo و Cucumis melo گزارش شدهاست.
این ویروس باعث کاهش چشمگیري در میزان محصول برخی زراعتها از جمله گیاهان خانواده کدوئیان می شود. سویهها و نژادهاي متنوعی براي این ویروس تاکنون گزارش شده است - . - 4 بسته به سویه ویروس، حساسیت میزبان و شرایط محیطی نوع و شدت علائم متفاوت بوده و به صورت تغییرات رنگ شامل موزائیک، پیسک، سبزردي ،زردي و نیز انواع بدشکلیها در برگها مشاهدهمیشود - 4 و . - 5 شناسایی منابع آلودگی و میزبانهاي غیرزراعی نگهدارنده ویروس در مدیریت کنترل بیماري از اهمیت زیادي برخوردار است. در این تحقیق، براي اولین بار در کشور، آلودگی گیاه کرفس وحشی - Apium graveolens - به ویروس CMV با استفاده از روش سرولوژیکی الایزا و نیز روش مولکولی واکنش زنجیرهاي پلیمراز بررسی و تائید گردید. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس از این علف می باشد.
مواد و روش ها:
در تابستان سال 1388 تعداد 17 نمونه از گیاه کرفس وحشی - Apium graveolens - با علائم موزائیک و پیسک همراه با بدشکلی برگها و کاهش رشد در حاشیه برخی مزارع در استان لرستان مشاهده و جمعآوري گردید. این نمونهها از نظر آلودگی به ویروسهاي Alfalfa mosaic virus-AlMV، Arabis mosaic virus-ArMV، Cucumber mosaic virus-CMV، Tomato ring spot virus-ToRSV و Tomato spotted wilt virus-TSWV به روش سرولوژیکی DAS-ELISA و با استفاده از آنتیبادیهاي اختصاصی ویروسهاي فوق مورد آزمون قرار گرفتند - . - 3 آنتیبادي اختصاصی به همراه شاهد مثبت و منفی مربوطه از شرکت بیوربا سوئیس تهیه شده و طبق روش توصیه شده توسط شرکت به کار رفتند.
بشقابک هاي الایزا از نوع میکرولون - هاي باندینک،-گرینر آلمان - بوده و حجم واکنشها 100 میکرولیتر انتخاب شد . نمونههاي برگی در بافر فسفات نمکی PBS حاوي 0/05 درصد از توئین با اسیدیته 7/4 به نسبت 1 گرم بافت در 10 میلی لیتر بافر عصارهگیري شدند. نتایج واکنشها یک ساعت بعد از افزودن محلول سوبسترا، توسط دستگاه الایزا ریدر مدل مولتی اسکن - کارخانه لبسیستم، فنلاند - در طول موج 405 نانومتر مورد خوانش قرار گرفت. نمونههایی که میزان جذب نوري چاهک مربوطه برابر یا بزرگتر از سه برابر میانگین جذب مربوط به شاهد سالم بود به عنوان نمونههاي با واکنش مثبت - آلوده - در نظر گرفته شدند.
نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند، انتخاب شده و در بافر فسفات 0/1 مولار با اسیدیته 7/2 عصارهگیري و روي گیاهان محک شامل Ving unguiculata، Nicotiana tabacum cv. samsun، N.tabacum cv. White Burley و N. glutinosa مایه زنی مکانیکی شدند. این گیاهان در شرایط گلخانه دماي 25±5 درجه سانتیگراد، رطوبی نسبی 60±10 درصد، شدت نور 12±2 هزار لوکس با تناوب 14 ساعت روشنایی نگهداري شده و علائم حاصل در آنها مورد مشاهده و یادداشتبرداري قرار گرفت.
همچنین نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند، انتخاب شده و آر.ان.اي کل آنها با استفاده از محلول تري- ریئجنت - سیگما، آمریکا - و طبق روش توصیه شده توسط شرکت سازنده استخراج شد. جهت بررسی کمیت و کیفیت نوکلئیک اسید استخراجی، از روش اسپکتروفتومتري و نیز الکتروفورز در ژل آگارز %1 استفاده شد. ناحیه ژن پروتئین پوششی ویروس طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز بروش رونوشتبرداري برگردان - آر.تی-پی.سی. آر - بصورت دو مرحلهاي و بکمک آغازگرهاي اختصاصی CMV و روش توصیفی توسط چوي و همکاران - 1999 - تکثیر شد - . - 2 محصول واکنش زنجیرهاي پلی مراز بر روي ژل آگارز %1 الکتروفوز شده و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید - یک میکروگرم در یک میلیلیتر - در نور ماورابنفش مورد مشاهده و ثبت قرارگرفت.
نتایج و بحث:
از 17 نمونه علائمدار جمعآوري شده، تعداد 12 نمونه با آنتیبادي اختصاصی ویروس CMV واکنش مثبت داشته و سایر نمونهها و شاهد سالم فاقد واکنش مثبت بودند. مهمترین علائم همراه با نمونههاي داراي واکنش مثبت عبارت از موزائیک و بدشکلی مختصر برگها بود. چهار تا پنج روز پس از مایهزنی نمونههاي مثبت در آزمون الایزا، علائم لکههاي موضعی نکروزه در گیاهان لوبیا چشم بلبلی - Vigna unguiculata - و سلمهتره - Chenopodium quinoa - ظاهر شده و حدود 10 روز بعد در گیاهان N. tabacum cv. samsun، N. tabacum cv. White burley و N. glutinosa علائم موزائیک و بدشکلی برگها ظاهر شده و سیستمیک شدن ویروس در این گیاهان از طریق آزمون الایزا مورد بررسی و تایید قرار گرفت.
این علائم با خصوصیات توصیف شده در مورد ویروس CMV مطابقت دارد - . - 4 نتایج حاصل از الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز در ژل آگارز نشاندهنده تکثیر قطعهاي باندازه حدود 940 جفت باز بود که با اندازه مورد انتظار مطابقت داشت - . - 2 تمامی 12 نمونهاي که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند طی آزمون پی.سی.آر با آغازگرهاي اختصاصی ویروس CMV واکنش مثبت داشته و طی آن قطعهاي با اندازه مورد انتظار ساخته شد. مجموع نتایج حاصل از بررسیهاي بیولوژیکی، سرولوژیکی و مولکولی نشاندهنده آلودگی نمونههاي کرفس وحشی مورد بررسی به ویروس موزائیک خیار است. این اولین گزارش از آلودگی طبیعی گیاه کرفس وحشی به ویروس موزائیک خیار در کشور میباشد که توسط روش مولکولی پی.سی.آر مورد ردیابی و تایید قرار گرفت.
تشکر و قدردانی:
هزینه انجام این پژوهش توسط موسسه تحقیقات گیاه پزشکی کشور تأمین شده است که تشکر می گردد.
