بخشی از مقاله
چکیده:
ویروس زردي غربی چغندرقند - Beet western yellows virus-BWYV - از ویروسهاي مهم بیمارگر با دامنه میزبانی نسبتا وسیع در گیاهان میباشد. این ویروس با پیکرههاي ایزومتریک بقطر 25 تا 26 نانومتر عضو جنس Polerovirus از خانواده Luteoviridae میباشد. طی سال 1388 تعداد 33 نمونه ماشک زراعی - Vicia sativa - با علائم بدشکلی و زردي برگها، کاهش رشد همراه با ارغوانی شدن نسبی حاشیه برگها، در تعدادي از مزارع ماشک آذربایجان شرقی و غربی مشاهده و جمعآوري گردید.
این نمونهها با استفاده از آنتیبادي اختصاصی علیه ویروس BWYV به روش DAS-ELISA مورد آزمون قرار گرفتند. تعداد 9 نمونه با آنتیبادي اختصاصی این ویروس داراي واکنش مثبت بودند در حالیکه سایر نمونهها و نیز شاهد سالم فاقد واکنش مثبت بودند. نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند انتخاب شده و آر.ان.اي کل آنها استخراج شد. حضور BWYV در آنها با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی و بکمک واکنش زنجیرهاي پلیمراز مورد بررسی قرار گرفت .
طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز، در تمام 9 نمونه مورد بررسی، قطعهاي باندازه حدود 560 جفت باز ساخته شد که با اندازه مورد انتظار مطابقت داشت. نتایج حاصل از مقایسه توالی نوکلئوتیدي این قطعه با سایر توالیهاي قابل دسترسی در بانک ژن با استفاده از ابزار جستجوي BLAST، نشان داد که این توالی داراي بیشترین مشابهت - بالاي 99 درصد - با توالیهاي ثبت شده در مورد ویروس BWYV میباشد. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز بوده و طی این مطالعه گیاه ماشک - Vicia sativa - بعنوان میزبان جدید این ویروس در ایران شناسایی و معرفی میگردد.
مقدمه:
ویروس زردي غربی چغندرقند - Beet western yellows virus-BWYV - عضو جنس Polerovirus از خانواده Luteoviridae میباشد. این ویروس داراي پیکرههاي ایزومتریک به قطر حدود 25 تا 27 نانومتر است. ژنوم آن متشکل از یک مولکول آر.ان.اي تک رشتهاي بطول 5/6 کیلوباز میباشد. این ویروس داراي دامنه میزبانی نسبتا وسیعی است و در 150 گونه از 23 خانواده گیاهی میتواند ایجاد آلودگی و بیماري نماید 2 - و . - 7 این ویروس توسط چندین گونه شته بروش پایا منتقل شده و گزارشی از انتقال آن توسط بذر، گرده یا تماس بین گیاهان وجود ندارد. این ویروس در گیاهان زراعی و باغی و نیز گیاهان غیر زراعی متعددي ایجاد بیماري می نماید.
از جمله میزبانهاي مهم این ویروس می توان به چغندرقند، کروسیفرها و برخی لگومها اشاره نمود. علائم آلودگی معمولا بصورت زردي، کاهش رشد و کلفتی و شکنندگی برگهاي مسنتر بروز مینماید - 2 و . - 6 در تابستان 1388 تعدادي بوته ماشک - Vicia sativa - با علائم زردي برگها و کاهش رشد در مزارع استانهاي آذربایجانشرقی و غربی مشاهده و نمونهبرداري گردید. در این تحقیق، آلودگی این نمونهها به ویروس زردي غربی چغندرقند با استفاده از روش هاي سرولوژیکی الایزا و نیز روش مولکولی واکنش زنجیرهاي پلیمراز بررسی و تایید گردید. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس از گیاه ماشک در کشور میباشد.
مواد و روشها:
در تابستان سال 1388 تعدادي از بوتههاي ماشک - V. sativa - با علائم سبزردي برگهاي بالایی و ارغوانی شدن حاشیه برگهاي مسنتر، همراه با کاهش رشد در برخی مزارع استانهاي آذربایجانشرقی و غربی مشاهده گردید. از این بوتهها نمونهبرداري شده و نمونهها در جعبه یونولیتی حاوي یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. مجموعا تعداد 33 نمونه برگی علائمدار تهیه شد. این نمونهها از نظر آلودگی به ویروسهاي Alfalfa mosaic virus-AMV ، Bean yellow mosaic virus-BYMV، Bean common mosaic virus-BCMV، Cucumber mosaic virus-CMV و Beet westen yellows virus-BWYV به روش سرولوژیکی DAS-ELISA مورد آزمون قرارگرفتند . - 3 - آنتیبادي اختصاصی هر یک از این ویروسها بهمراه شاهد مثبت و منفی مربوطه از شرکت بیوربا سوئیس تهیه شده و طبق توصیه شرکت سازندة آنها بکار رفتند.
بشقابکهاي الایزا از نوع گرینر - هايبایندینگ، ساخت آلمان - بوده و حجم واکنشها 100 میکرولیتر انتخاب شد. نمونههاي برگی در بافر عصارهگیري شامل بافر تریس 0/1 مولار با اسیدیته 8/2 و به نسبت 1 گرم بافت در 10 میلیلیتر بافر، له و عصاره گیري شدند. پس از اتمام آزمون، نتایج واکنشها یک ساعت بعد از افزودن سوبسترا، توسط دستگاه الایزا ریدر مدل مولتی اسکن، ساخت کارخانه لبسیستم فنلاند در طول موج 405 نانومتر مورد خوانش قرار گرفت. نمونههایی که میزان جذب نوري چاهک مربوطه برابر یا بزرگتر از سه برابر میانگین جذب مربوط به شاهد سالم بود، بعنوان نمونههاي با واکنش مثبت - آلوده - در نظر گرفته شدند.
نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت با آنتیبادي اختصاصی ویروس BWYV بودند انتخاب شده و در مرحله بعد آر.ان.اي کل گیاهی آنها با استفاده از محلول تجاري تري-ریئجنت - سیگما، آمریکا - و طبق روش توصیه شده توسط شرکت سازنده استخراج شد. جهت بررسی کمیت و کیفیت نوکلئیک اسید استخراجی، از روش اسپکتروفتومتري و نیز الکتروفورز در ژل آگارز %1 استفاده شد. بمنظور تایید نتایج آزمون الایزا، از آغازگرها و روش واکنش زنجیرهاي پلیمراز و نقشه تحدید توصیفی توسط هائوسر و همکاران - 2000 - استفاده شد . - 5 - محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز، روي ژل آگارز %1 الکتروفورز شده و پس از رنگآمیزي با اتیدیوم بروماید - یک میکروگرم در میلیلیتر - ، در نور ماورابنفش مورد مشاهده قرار گرفت.
همچنین قطعه دي.ان.اي تکثیر یافته طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از کیت تجاري استخراج محصول پی.سی.آر ساخت شرکت MN - آلمان - ، استخراج و خالصسازي شده و بطور مستقیم و با استفاده از سرویسهاي تجاري موجود تعیین توالی گردید. عمل خواندن و تعیین توالی قطعه در هر دو جهت و با استفاده از آغازگرها اختصاصی مربوطه انجام گردید. توالی حاصل در مورد جدایه مورد بررسی با استفاده از ابزار جستجوي BLAST موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI با سایر توالیهاي ثبت شده در بانک ژن مورد مقایسه قرار گرفت . - 1 -
نتایج و بحث:
از بین 33 نمونه برگی علائمدار ماشک، تعداد 9 مورد با آنتی بادي اختصاصی ویروس BWYV داراي واکنش مثبت بودند. مشخصترین علائم همراه با این نمونهها، زردي، ارغوانی شدن حاشیه برگهاي مسن و کاهش رشد آنها بود که با علائم توصیف شده در مورد ویروس BWYV مطابقت داشت 2 - و . - 6 با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی BWYV، طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز، در تمامی 9 نمونه مثبت در آزمون الایزا، یک قطعه دي.ان.اي بطول حدود 560 جفت باز تکثیر گردید که با اندازه قطعه مورد انتظار مطابقت داشته - 5 - و در نمونههاي شاهد سالم چنین قطعهاي مشاهده نشد. نتایج حاصل از مقایسه توالی نوکلئوتیدي این قطعه با سایر توالیهاي قابل دسترسی در بانک ژن با استفاده از ابزار جستجوي BLAST، نشان داد که این توالی داراي بیشترین مشابهت - بالاي 99 درصد - با توالیهاي ثبت شده در مورد ویروس زردي غربی چغندرقند میباشد.
ویروس زردي غربی چغندرقند با استفاده از روشهاي سرولوژیکی مانند الایزا قبلا از روي چغندرقند، کلزا و نخود از ایران گزارش شده است - 4 - ولی این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز بوده و طی این مطالعه گیاه ماشک - Vicia sativa - بعنوان یک میزبان جدید این ویروس در ایران شناسایی و معرفی گردید. ویروس BWYV در زراعتهاي چغندرقند و کلزا میتواند موجب کاهش محصول چشمگیر گردد 6 - و . - 7 شناسایی میزبانهاي طبیعی ویروس BWYV از نیازهاي اصلی براي مدیریت و کاهش خسارت ناشی از آن محسوب میگردد.
تشکر و قدردانی:
از موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور که هزینه انجام این پژوهش را تامین کرده است، تشکر میگردد.
