بخشی از مقاله
چکیده
زمینه و هدف: اسهال ویروسی گاو - BVD - یکی از مهم ترین بیماری های صنعت گاو در سراسر جهان است و همواره خسارات اقتصادی قابل توجهی را بر این صنعت وارد می سازد. عامل این بیماری می تواند منجر به طیف وسیعی از علائم بالینی گردد. شناسایی اشکال عفونتهای حاد ویروس اسهال گاوان از نظر حفاظت زیستی به اندازه تشخیص حیوانات با عفونت پایدار دارای اهمیت میباشد. هدف از مطالعه حاظر ارزیابی تشخیص بالینی در مقایسه با روش RT-PCR در حیوانات دارای علائم بالینی مشکوک به این بیماری بود.
مواد و روش کار: ازخون 80 رأس گاو که 63 رأس آنها دارای علائم بالینی مشکوک به این بیماری از قبیل تب، اسهال،مشکلات تنفسی، بیحالی وضعف، کارتاراکت چشمی و کمبود رشد و 17 رأس دیگر فاقد علائم بالینی بود نمونه گیریانجام شد. بافی کوت نمونهها بعد از لیز گلبولهای قرمز به منظور انجام عمل استخراج RNA برداشته شد. تشخیص مولکولی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ویروس اسهال گاوان با تکنیک RT-PCR انجام شد. از آزمون دقیق فیشر ولوجستیک برای مشخص شدن ارتباط میان وجود ویروس اسهال ویروسی گاو و علائم بالینی استفاده شد.
یافته ها :از 61 گاو ماده 14 نمونه - %23 - و از 19 گاو نر 6 نمونه - - %31/6 از نظر آلودگی به ویروس BVD مثبت بودند.آزمون دقیق فیشر نشان داد بین جنس و آلودگی ارتباط معناداری وجود ندارد . - P>0/05 - شانس آلودگی گاوهای نر 1/55برابر گاوهای ماده میباشد - فاصله اطمینان %95، . - 0/5-4/84 نسبت شانس بین سن و آلودگی برابر با 0/75 میباشد - فاصله اطمینان %95، %31/7 . - 0/48-1/18 از گاوهایی که در بالین دارای نشانه بودند از نظر آلودگی ویروس مثبت بودند. بین وجود نشانههای بالینی و آلودگی با استفاده از آزمون دقیق فیشر ارتباط معنا دار یافت شد . - P<0/01 - با استفاده از آزمون لوجستیک سن و جنسیت به ترتیب %3/3 و %1 از تغییرات بیماری را توجیح میکند.
بحث و نتیجهگیری: همانطوری که نتایج نشان میدهند شناسایی ظاهری این بیماری از طریق علائم بالینی خیلی قابل اعتماد نیست، و این میتواند بهدلیل شباهت علائم این بیماری با سایر بیماریهایی حاصل از ویروسها، باکتریها و تک یاختهها و کمبودهای مواد معدنی باشد و لذا برای تشخیص قطعی عامل بیماری از سایر تست های تکمیلی از جمله PCR و الیزا باید کمک گرفت.
کلید واژه: اسهال ویروسی گاوان BVD، RT-PCR، علائم بالینی
مقدمه
اسهال ویروسی گاو - BVD - 1 یکی از مهم ترین بیماری های صنعت گاو در سراسر جهان است و همواره خسارات اقتصادی قابل توجهی را بر این صنعت وارد می سازد Gunn - وهمکاران، 2005؛ Fourichon و همکارن - . عامل مولد اسهال ویروسی گاوها متعلق به جنس پستی ویروس2 از خانواده فلاوی ویریده3 است. خانواده فلاوی ویریده دارای سه جنس فلاوی ویروس، پستی ویروس و هپاسی ویروس می باشد. اعضای خانواده فلاوی ویریده اگرچه از لحاظ خواص ژنومی و فیزیکو شیمایی به هم شباهت دارند ولی از نظر خواص بیولوژیک کاملا متفاوتند. جنس پستی ویروس شامل اسهال ویروسی گاو - BVD - ، ویروس بیماری بوردر - BD - 4 و ویروس طاعون خوکی - HOCV - 5 بوده که هرکدام از نظر بیماریزایی و مخاطرات اقتصادی دارای اهمیت ویژه ای در دامپزشکی هستند - کارگر موخر و همکاران، 1383؛ Houe وهمکاران، . - 1995
اسهال ویروسی گاوی در سال 1946 به عنوان یک بیماری جدید در گاو شناخته شد - Brock و همکاران، . - 2004 و سپس در دهه 1950 شکل بالینی دیگر آن یعنی بیماری مخاطی، کشف شد که از بعضی جنبه ها مانند شدت بیماری و الگوی بروز در گله با بیماری قبلی تفاوت داشت. ویروس های جدا شده از هر دو بیماری مشخص کرد که هر دو، عامل یکسانی دارند - Parida و همکاران، . - 2004 این بیماری در بیش از 50 سال پیش برای اولین بار در آمریکا مورد توجه قرار گرفت و امروزه درصد شیوع آلودگی با عامل آن در کشورهای مختلف از 10 تا نزدیک به 100 درصد برآورد شده است Smith - و همکاران،2007؛ Brok و همکاران، . - 2004 این ویروس دستگاهای تولید مثل، تنفس، گوارش، قلبی-عروقی، سیستم ایمنی، سیستم لنفاوی، عضلانی-اسکلتی، پوششی، و سیستم اعصاب مرکزی را متاثر می سازد - کارگرموخر و همکاران، 1383؛ Baszler و همکاران، . - 1995
عفونت زمان جنینی باعث بروز حالت تحمل وایجاد گوساله های با عفونت پایدار - PI - 6 می شود، این گوساله ها بعدا در صورت برخورد با سویه دیگر ویروس به بیماری حاد و کشنده مخاطی MD 7 مبتلا می شوند - Nettleton و همکاران، 1995؛ sagar و همکاران، 2005؛ Baszler و همکاران، . - 1995 بیماری اسهال ویروسی گاوی دارای پیامدهایی چون: مرگ زودرس، سقط جنین، نواقص مادرزادی، رشد ضعیف گوساله های مبتلا، اختلال عملکردی دستگاه تولید مثلی، تضعیف سیستم ایمنی و در نتیجه استعداد دام برای ابتلای به عفونت های فرصت طلب است. میزان تلفات بالای موارد مبتلای به بیماری مخاطی، تنها بخشی از دلایل اهمیت و اقتصادی بودن این عفونت است که باعث شده در بسیاری از کشورهای جهان سیاست های جدی و هزینه های هنگفتی در جهت کنترل، پیشگیری و حتی ریشه کنی آن از گله های درگیر به کارگرفته شود - Kafi و همکاران، . - 2001
از میان اکثر علائم بالینی که در بیماری اسهال ویروسی گاو دیده می شود با برخی از بیمارای های دیگر مشابه است و از این موارد می توان به ایجاد اسهال توسط عوامل ویروسی از قبیل روتا ویروسها و کوروناویروس و کریپتوسپوریدیوم و اشریشا کلی، سالمونلا تیفیموریوم و سالمونلا دبلی - Brandao و همکاران، 2007؛ Huppertz و همکارن، 1999؛ Watson و همکاران، . - 1995 و همچنین در مورد موارد تنفسی می توان به مایکوباکتریوم بوویس و پنومونی پاستورولایی Dabo - و همکاران، 2007؛ Pollock وهمکاران، - 2002 اشاره کرد. هدف از انجام این پژوهش بررسی میزان تطابق میان نتایج حاصل از شناسایی ویروس اسهال گاو از لحاظ علائم بالینی با نتایج حاصل از تکنیک RT-PCR می باشد.
مواد و روش ها
از 80 گاو و گوساله که 63 رأس آنها از نظر بالینی دارای علائم اولیه از قبیل اسهال، تب، لاغری، بیحالی، کمبود رشد، مشکلات تنفسی بودند نمونهگیری صورت گرفت. کلیه علائم بالینی این دامها همچنین سن وجنس نمونه ها ثبت شد. حدود 5 سیسی خون از وداج گاو 80 رأس با استفاده از ونوجکت خلاءدار حاوی 1-2 - EDTA میلیگرم به ازایهر سیسی خون - تهیه گردید و در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل گردید و هم حجم آن محلول لیزکننده گلبول قرمز ACT - حاوی 140 میلیمولار NH4Cl به همراه 17 میلیمولار Tris با 37 - PH=7/3 درجه سلسیوس اضافه گردید. محلول را به آرامی تکان داده با بافر و خون به خوبی با هم مخلوط شوند.
این بافر باعث لیز شدن گلبول های قرمز میشود. لوله حاوی مخلوط خون و محلول لیز کننده به مدت 5 دقیقه در دور 4000 rpm سانتریفیوژ گردید. سپس محلول بالایی را دور ریخته و گلبول های سفید در ته لوله باقی میمانند. این عمل را می توان تا شفاف شدن گلبول های سفید یک یا دوبار تکرار کرد. بافی کوت ته لوله را با محلول 137 - PBs میلی مولار NaCl، 7/2 میلیمولار KCl، 10 میلی-مولارNa2HPO4، 2 میلیمولار KH2PO4 با 37 - PH=7/4 درجه سلسیوس شستشو و به مدت 5 دقیقه در دور 4000 rpm سانتریفیوژ گردید. در این حالت میتوان بافی کوت را فریز و برای انجام عمل استخراج را بعد انجام داد - محمدی و همکاران، . - 1391
استخراج RNA
به بافی کوت نمونههای خونی مقدار 1 ملی لیتر محلول 3OXV-51; افزوده و ورتکس شد. مخلوط بدست آمده به مدت 5 دقیقه در دمای محیط انکوبه گشت. سپس 0/2 میلیلیتر کلرروفورم به آن افزوده و به شدت تکان داده شد. مخلوط، به مدت 5 دقیقه روی یخ انکوبه و پس از آن با دور 12000 rpm به مدت 15 دقیقه با دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ گردید. محلول رویی به یک میکروتیوب جدید منتقل گشت و به آن 0/5 میلیلیتر ایزوپروپانول افزوده و با چند بار سرو ته کردن، مخلوط شد. سپس به مدت 15 دقیقه بر روی یخ انکوباسیون انجام گرفت. در مرحله بعد، با دور12000 rpm به مدت 15 دقیقه با دمای 4 درجه سانتیگراد افزوده شد. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی تخلیه و رسوب بدست آمده با 1 میلی لیتر اتانول 75 درصد شستشو و ورتکس گشت. یک مرحله سانتریفیوژ با دور 7500 rpm به مدت 8 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از پایان سانتریفیوژ، الکل روی رسوب تخلیه شده و به منظور خشک شدن رسوب، به مدت 30 دقیقه زیر هود قرار گرفت. در نهایت، رسوب 51$ در حجم 30 آب عاری از 51DVH حل شد.
سنتز cDNA
10 میکرولیتر از 51$ استخراج شده به یک میکروتیوب استریل منتقل گشت. 0/5 میکرولیتر - 10 PRO// - از پرایمرVilcek - - Reverse - 5 TCA ACT CCA TGT GCC ATG TAC 3 و همکاران، - 1994 و 2 میکرولیتر آب دوبار تقطیر به آن افزوده و به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پس از به پایان رسیدن زمان
