بخشی از مقاله
چکیده
نهال سالم و اصیل به عنوان شالوده اساسی در توسعه صنعت باغبانی دنیا مطرح است. این نهاده ارزشمند در کشورهاي توسعه یافته از باغات مادري که مواد اولیه آن از هسته هاي اولیه سالم تهیه شده است، تامین می گردد. زمانیکه هسته هاي اولیه سالم موجود نباشد، سالم سازي ارقام موجود با تکیه بر روش هاي ترموتراپی، بیوشیمیایی و کشت بافت بویژه کشت مریستم انتهایی براي عاري سازي ماده تکثیري از عوامل بیماري زاي مورد نظر انجام گرفته و مواد تکثیري سالم به عنوان هسته اولیه براي استفاده در توسعه باغات مادري و نهال سالم و اصیل در اسکرین هاوس نگهداري می شوند. اما این روش ها علیرغم نیاز به امکانات آزمایشگاهی بالا و نیروي انسانی متخصص از گرایشات مختلف کشاورزي، همیشه موفق نبوده اند.
روش جایگزین، اسکرین ارقام موجود با روش هاي مختلف بیماري شناسی، انتخاب منابع سالم و اصیل و در نهایت تکثیر و نگهداري آنها در اسکرین هاوس است. در این پروژه تحقیقاتی ارقام اصیل زیتون در استان هاي زنجان، گیلان و خوزستان با روش هاي سرولوژیکی و مولکولی مبتنی بر اسید نوکلئیک از نظر آلودگی به بیماریهاي ویروسی مندرج در استانداردهاي ملی سلامت زیتون ArMV - ، CLRV و - CMV و SLRSV مورد ارزیابی قرار گرفته و همزمان از درختان مذکور نمونه هایی به عنوان منابع اصیل در گلخانه پرورش و نگهداري شدند. منابع پرورش یافته در مراحل مختلف رشد چندین بار با روش هاي فوق براي ردیابی عوامل مذکور مورد ارزیابی قرار گرفته و در نهایت تعداد 124 نهال سالم مربوط به هفت رقم از بین آنها انتخاب شدند.
مقدمه
سلامت نهال در کنار اصالت آن لازمه گام نهادن در مسیر باغبانی پایدار، توسعه صنعت مدرن باغبانی و استفاده بهینه از این صنعت است. طیف وسیعی از عوامل بیماري زاي مختلف گیاهی - ویروس ها، ویروئیدها، شبه ویروس ها، پروکاریوت ها، قارچ ها و نماتد ها - درختان باغی میوه اي و غیر میوه اي را از نظر کمی و کیفی تحت تاثیر قرار داده و در کوتاه مدت یا بلند مدت باعث زوال باغات می شوند. آلودگی به برخی از این عوامل از جمله عوامل بیماري هاي ناشی از سه گروه اول بسته به نوع عامل و میزبان آن ها معمولا بدون نشانه هاي بارز بیماري هستند که به همین دلیل غالبا در پروسه تولید نهال مورد بررسی قرار نگرفته یا روش هاي بکار رفته در ارزیابی آلودگی به این عوامل، قادر به ردیابی آنها در بافت هاي آلوده گیاهی نیستند.
با توجه به تکثیر غیر جنسی نهال، عوامل بیماري زاي فوق بویژه عوامل بیماري زاي سیستمیک - مانند ویروس ها، ویروئیدها، شبه ویروس ها، فایتوپلاسماها و تعداد معدودي از باکتري ها و قارچ ها - معمولا به آسانی از طریق مواد تکثیري - پایه، پیوندك، قلمه، پاجوش و ... - به نهال منتقل شده و عملا آلودگی ها بدون دخالت عوامل زنده محیطی به باغ تازه تاسیس شده وارد می شوند. مضافا اینکه تعدادي از همین عوامل از طریق ناقلین بیولوژیکی، بذر و دانه گرده نیز منتقل می شوند. عوامل بیماري زاي ویروسی و شبه ویروسی در زیتون معمولا فاقد علائم بیماري بوده، گیاهان محک براي ردیابی آنها از زیتون تاکنون معرفی نشده و حتی ردیابی آنها با روش هاي معمول بیماري شناسی مانند روش هاي سرولوژیکی در این گیاه به سختی انجام می گیرد.
Albanese et al., 20; Bertolini et .al., 2001; Al Abdullah et al., 2005 - به همین دلیل از روش هاي مبتنی بر اسید نوکلئیک مانند Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction - RT-PCR - و استخراج و بررسی Double Stranded RNA - dsRNA - براي ردیابی عوامل بیماري زاي ویروسی و شبه ویروسی - به ترتیب - در زیتون استفاده می شود .Naderpour et al., 2014, 2015; Fadel et al., 2005; Varanda et al., 2010 - شناخته شده ترین روش ها در تهیه هسته هاي اولیه سالم درختان باغی ترموتراپی، روش هاي بیوشیمیایی، کشت مریستم انتهایی یا ترکیبی از دو یا هر سه روش می باشد. بدلیل عدم موفقیت صد در صد این روش ها در از بین بردن عوامل بیماري زا، ردیابی این عوامل نیز پس از هر روش امري ضروري و لازم الاجرا است.
هر چند که این روش ها در تهیه منابع سالم بسیار مهم هستند ولی هزینه بالا، عدم موفقیت صد در صد در عاري سازي از آلودگی هاي موجود و از همه مهمترامکان بروز موتاسیون بویژه در مراحل کشت مریستم انتهایی و از بین رفتن اصالت از جمله معایب این روش ها محسوب می شوند - Wang et al., 2006; Koubouris et al., 2007; Rongrong et al., 2010; .unpublished data, SPCRI - بنابراین غربالگري عوامل بیماري زاي درختان باغی اصیل و سازگار با شرایط منطقه در باغات موجود در فضاي باز به منظور انتخاب ارقام سالم، تهیه نمونه هایی زنده از آنها و نگهداري در شرایط غیر قابل نفوذ به عوامل بیماري زا و ناقلین بیولوژیکی آنها - اسکرین هاوس - به دلیل امکان آلودگی منابع سالم در فضاهاي باز و ارزیابی منابع موجود در اسکرین هاوس در دوره هاي مختلف با روش هاي حساس می تواند به عنوان روش جایگزین مطرح باشد که در تحقیق حاضر در مورد زیتون انجام شده است.
مواد و روشها
مواد آزمایشی این تحقیق درختان مادري اصیل و شناسه دار زیتون از ارقام - زرد، روغنی، شنگه، گلوله و ماري - ، - زرد، روغنی، شنگه، گلوله، ماري وفیشمی - و - باغملک و روغنی - به ترتیب در مراکز تحقیقات و آموزش کشاورزي و منابع طبیعی استان هاي زنجان - طارم - ، گیلان - رودبار - و خوزستان - صفی آباد - بود. اصالت هر کدام از این ارقام قبلا در پروژه تحقیقاتی مشترك بین موسسه تحقیقات ثبت و گواهی بذر و نهال وپژوهشکده بیوتکنولوژي کشاورزي از طریق انگشت نگاري ژنتیکی به اثبات رسیده است . - Ghareyazi et al., 2005 - نمونه هاي برگ و شاخه از مجموع 39 درخت شناسه دار متعلق به ارقام روغنی 11 - درخت - ، زرد 7 - درخت - ، شنگه 7 - درخت - ، گلوله 5 - درخت - ، ماري 5 - درخت - ، باغملک 1 - درخت - و فیشمی 3 - درخت - جمع آوري شده و در روي یخ به آزمایشگاه منتقل شدند.
همزمان شاخه هاي یکساله به تعداد 20 شاخه از هر درخت انتخاب و پس از تیمار با ایندول بوتیریک اسید در مخلوط خاك و ماسه - به نسبت یکسان - در گلدان کشت شده و در شرایط گلخانه نگهداري شدند. نمونه ها با استفاد از آنتی بادي هاي اختصاصی ویروس هاي Arabis mosaic virus - ArMV - ، Cherry leafroll virus - CLRV - ، Cucumber mosaic virus - CMV - - مندرج در استانداردهاي ملی سلامت زیتون - و Strawberry latent ringspot virus - SLRSV - تهیه شده از شرکت هاي Agdia - USA - و Bioreba - Switzerland - و آزمون هاي سرولوژیکی مورد ارزیابی قرار گرفتند. همزمان از نمونه هاي مذکور، RNA ژنومی با استفاده از کیت استخراج RNA - Qiagene, Germany - استخراج شده و آلودگی/سلامت نمونه ها با استفاده از پروتکل هاي بهینه سازي شده/توسعه یافته در موسسه متبوع - Naderpour et al., 2014, 2015 - با آزمونهاي RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفتند.
کنترل مثبت این آزمون ها نمونه هاي آلوده یه ویروس ها بود که از نقاط مختلف کشور از میزبان هاي متفاوت از جمله زیتون ردیابی شده بودند. کنترل مثبت ویروس SLRSV از شرکت تامین کننده آنتی بادي تهیه شد. به منظور تایید بیشتر نتایج آزمون هاي RT-PCR ، باندهاي تک گانه تکثیر شده ار نمونه هاي کنترل مثبت پس از جداسازي از ژل آگارز و خالص سازي با کیت استخراجDNA از ژل Qiagen - Germany - ، به طور مستقیم در شرکت MWG, Europhines - Germany - ترادف یابی شدند. نهال هاي رشد یافته در گلخانه به همان ترتیب با آزمون هاي فوق از نظر آلودگی به هر چهار ویروس بررسی شدند. در نهایت RNA دو رشته اي - dsRNA - از همه نمونه ها با کمی تغییرات در روش توصیه شده - Dodds et al., 1984 - استخراج شده و در روي ژل هاي آگارز و پلی اکریل آماید از نظر احتمال آلودگی نمونه ها به dsRNA ویروس ها و شبه ویروس ها مطالعه گردید.
نتایج و بحث
آزمون هاي سرولوژیکی با آنتی بادي هاي اختصاصی ویروس هاي ArMV، CLRV، CMV و SLRSV در بین نمونه هاي جمع آوري شده از باغات شناسه دار زیتون و نیز نهال هاي تهیه شده از همان درختان، هیچ گونه آلودگی به این ویروس ها را نشان نداد. با توجه به حساسیت بسیار بالاي روش هاي مولکولی مبتنی بر در ردیابی عوامل بیماري زا بویژه عواملی بیماري زاي ویروسی در زیتون 2005; Varanda et al., 2010 - ، از این روش ها براي ردیابی ویروس هاي مورد مطالعه در نمونه هاي جمع آوري شده با پروتکل هاي توسعه یافته - Naderpour et al., 2014, 2015 - استفاده شد.
به دلیل امکان از بین رفتن RNA کل استخراج شده از بافت هاي گیاهی در اثر ریبونوکلئازهاي اندمیک و/یا وجود بازدارنده هاي RT-PCR نظیر پلی ساکاریدها و پلی فنولیک ها در RNA مورد مطالعه، ابتدا از تکثیر قطعه اي از cDNA ژن کنترل داخلی - Nad5 - براي تایید کیفیت RNA استخراج شده و نیز درستی آزمون RT-PCR استفاده شد . - Naderpour et al., 2014, 2015; Menzel et al., 2002 - آزمون هاي RT-PCR از وجود ویروس هاي ArMV ، SLRSV و CLRV در نمونه هاي برخی از درختان مربوط به ارقام زرد، شنگه و ماري حکایت داشته ولی در بین نمونه هاي نهال هاي برگرفته از درختان فقط ویروس SLRSV در برخی از نهال هاي ارقام روغنی، ماري و زرد ردیابی شد.
این نتایج با نتایج منتشر شده قبلی مبنی بر حساسیت پایین آزمون هاي سرولوژیکی در ردیابی ویروس ها از زیتون و لزوم استفاده از واکنش هاي مبتنی بر اسید نوکلئیک در ردیابی عوامل بیماري زا همخوانی داشته و این روش ها را براي برنامه هاي گواهی نهال بسیار ضروري نشان داد .Fadel et al., 2001 - در نتایج بررسی dsRNA استخراج شده از نمونه ها، آلودگی به شبه ویروس ها مشاهده نگردید که البته شبه ویروس ها تاکنون از روي زیتون در کشور گزارش نشده اند.
به دلیل شرایط نامساعد محیطی در گلخانه نگهداري نهال هاي تهیه شده در این تحقیق، فقط تعداد 124 نهال از ارقام باغملک، روغنی، زرد، شنگه، گلوله، ماري و فیشمی سالم نگهداري شدند. نهال هاي مذکور در مراحل مختلف رشدي بارها با آزمون هاي فوق مورد مطالعه قرار گرفته و پس از اطمینان از سلامت آنها در اختیار برخی ارگان هاي خصوصی و دولتی براي تکثیر قرار گرفتند. نتایج این تحقیق نشان داد که در مواقعی که منابع سالم براي تهیه مواد تکثیري موجود نباشد و روش هاي سالم سازي- بنا به دلایل اشاره شده در قسمت مقدمه- قابل کاربرد نباشد، اسکرین ارقام موجود بر اساس استانداردهاي ملی سلامت و نگهداري منابع مورد مطالعه در اسکرین هاوس به منظور جلوگیري از آلودگی طبیعی می تواند روشی جایگزین باشد.
