بخشی از مقاله
چکیده
گونههای Paecilomyces formosus، یکی از عوامل بیماریزای سرخشکیدگی پسته، دارای تنوع ژنتیکی و ریخت شناسی بالایی می باشند که تاکنون مرحله جنسی آن در باغات پسته مشاهده نشده است. در این تحقیق امکان تشکیل مرحله جنسی در شرایط آزمایشگاه و گلخانه مورد بررسی قرار گرفت. از دو جفت آغازگر F1Varse و R2VarMar به ترتیب برای تکثیر Mat1-1 و Mat1-2 با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز چندگانه استفاده شد.
ایدیومورفهای تیپ آمیزشی برای 110 جدایه P. formosus جدا شده از درخت پسته و 10 جدایه جدا شده از درخت خرما - Phoenix dactylifera - تکثیر شدند. در نهایت در 46 جدایه Mat1-1 - %38/3 - و در 60 جدایه Mat1 -2 - %50 - و در 6 جدایه - %5 - از هر دو گروه تیپ آمیزشی تکثیر شدند و در 8 جدایه - %6/6 - هیچ باندی مشاهده نشد. در ادامه شش روش برای القای مرحله جنسی بین جدایههای با تیپ آمیزشی مخالف مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در شرایط آزمایشگاهی تپیپ های سازگار جنسی از نظر ژنتیکی قادر به تولید مثل جنسی نمیباشند. با توجه به نتایج حاصل چنین نتیجه گیری میشود که در طبیعت علاوه بر فاکتورهای ژنتیکی عوامل محیطی دیگری در ایجاد مرحله جنسی دخالت دارند.
-1 مقدمه
بیماری سرخشکیدگی درختان پسته Paecilomyces formosus یکی از مهمترین بیماریهایی است که در چند سال اخیر با پیشرفتی سریع باعث خشک شدن کامل درختان علاوه بر سرشاخهها شده است. قارچ Paecilomyces formosus، با فرم جنسی Byssochlamys sp. بهعنوان عامل اصلی بیماری، اولین بار در استان کرمان مشاهده شد .[1] برای اعمال برنامههای مدیریتی، شناسایی ارقام مقاوم و همچنین، مشاوره و قرنطینه، شناسایی جمعیت در سطح گونه و نژاد امری ضروری می باشد.
برای این منظور آگاهی از وضعیت تنوع ژنتیکی و همچنین نوع تولید مثل - جنسی یا غیرجنسی - در قارچ اهمیت زیادی دارد. آسکومیست ها با آنامورف هایی در جنس های Penicillium، Aspergillus و Paecilomyces در خانواده Trichocomaceae طبقه بندی میشوند .[2] ارتباط بین Paecilomyces با آسکومیست Byssochlamys اولین بار توسط [3] Stolk and Samson گزارش گردید. یک مطالعه مولکولی که اخیرا صورت گرفته نشان داده است که P. variotti یک کلاد قوی داخل Trichocomaceae با دیگر گونه های گرما دوست Paecilomyces و تلئومورف Byssochlamys تشکیل میدهد .
[4] این کلاد همچنین شامل Talaromyces spectabilis Udagawa & S. Suzuki با آنامورفی شبیه P. variotti نیز می باشد. بررسی های ریخت شناسی این جدایه ها نشان داد که تلئومورف Byssochlamys می باشد .[5] بررسی فراوانی و وقوع ژنهای تیپ آمیزشی در یک جمعیت روشی است برای بررسی احتمال بروز تولیدمثل جنسی، که مطالعات مشابهی در این زمینه در مورد A. fumigatus و P. maneffei مورد استفاده قرار گرفته است.
در مطالعه ای که برای طراحی آغازگر دژنره برای تکثیر ژنهای تیپ آمیزشی صورت گرفته بود نتایج بررسی آمیزشی، 1:1 مشخص شد که نشان دهنده حضور سیستم آمیزشی هتروتالیک دو آللی در P. variotti میباشد.[6] اما تا کنون مطالعه منسجمی بهمنظور مشخص نمودن پراکندگی تیپ آمیزشی و القای مرحله جنسی در این جنس صورت نگرفته است. هدف اول این مطالعه، تعیین تیپ آمیزشی جدایههای Paecilomyces formosus به کمک Multiplex PCR بود. در قدم بعد، امکان تشکیل مرحله جنسی در بین جدایههای منتخب در شرایط گلخانه و آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت.
-2 مواد و روش ها
-2-1 شناسایی جدایهها طی سال های 89-93 به طور تصادفی از باغ های پسته استان های یزد و کرمان نمونه برداری صورت گرفت، قارچهای به دست آمده با استفاده از محیط غذایی آب آگار بطور جداگانه به روش نوک ریسه و تک اسپوری خالص سازی شدند. سپس با تهیه لام میکروسکوپی از هر جدایه، شناسایی دقیق هر کدام از جدایهها با استفاده از کلیدهای معتبر انجام گرفت.
-2-2 استخراج DNA
به منظور تهیه میسیلیوم برای استخراج 1$ ، ابتدا قارچ روی محیط کشت 3 $ رشد داده شد تشتکهای پتری به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سانتی گراد نگهداری شدند و بعد از رشد کافی پرگنه قارچ، با استفاده از اسکالپل تمیز بافت قارچی از روی آن تراشیده شد و مستقیما مورد استفاده قرار گرفتند. استخراج DNA به روش CTAB انجام گرفت.[6]
-2-3 ردیابی ژنهای MAT
تکثیر نواحی منطقه حفاظت شده از ایدیومورف MAT-1 و MAT- 2 با استفاده از دو جفت آغازگر دژنره صورت گرفت .[6] جفت آغازگر F1Varse و R2VarMar برای تکثیر قطعه 1$ با طول حدود 334 جفت باز برای MAT-1 و جفت آغازگر F1Paec و R1Paec برای تکثیر قطعهای با طول حدود 188 جفت باز برای MAT-2 در روش multiplex PCR استفاده شدند. تکثیر قطعات 1$ با واکنش 3&5 در حجم 25 میکرولیتر انجام گرفت.
تعداد 35 سیکل حرارتی با دمای 95 درجه سانتی گراد - یک دقیقه - ، 48-55 درجه سانتی گراد - یک دقیقه - و 72 درجه سانتیگراد - یک دقیقه - بهترتیب برای واسرشت شدن، اتصال و بسط DNA در نظر گرفته شد. محصول حاصل از واکنش PCR روی ژل آگاروز 2 درصد در دستگاه الکتروفورز - Bio-Rad, USA - با ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقیقه الکتروفورز گردید. سپس نقوش الکتروفورزی حاصل زیر نور UV مشاهده و نتایج بهدست آمده توسط دستگاه ژل خوان - Bio-Rad, USA - 1 عکسبرداری و ثبت گردید. -2-4 تلقیح و انکوبه نمودن جدایههای منتخب بعد از گروه بندی جدایهها از نظر تیپ آمیزشی، جدایههای منتخب با تیپ آمیزشی مخالف در مقابل یکدیگر کشت شدند. به منظور مشاهده فرم جنسی و بررسی باروری جدایه های قارچ، از محیط کشتهای عصاره مالت آگار [6] و سیب زمینی دکستروز آگار[7] با کمک یکی از سه روش تلقیح زیر، استفاده گردید.
-2-4-1 روش : Barrage Zone دز این روش که براساس روش O,Gorman و همکاران [7] میباشد ابتدا از هر جدایه، تک اسپورهایی تهیه گردید که در شرایط القای اسپورزایی انکوبه شدند سپس اسپورها به کمک آب سترون حاوی توئین - 0.05% - Tween 80 درصد جمع آوری شدند. در هر تشتک پتری حاوی محیط کشت مالت آگار یا PDA، مقدار 1/5 تا 2 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپورهای با تیپ آمیزشی مخالف، روی سطح آگار در فاصله 3-4 سانتی متری از یکدیگر به صورت ستونی کشت گردیدند.
-2-4-2 روش استفاده از شاخههای پسته: بعد از تهیه محیط کشتهای مذکور، یک قطعه شاخه پسته سترون به طول 3-4 سانتی متر در مرکز تشتکهای پتری قرار داده شد .یک قرص میسلیومی از حاشیهی پرگنهی هفت روزه جدایهها برداشته شد و به صورت دو به دو و در دو طرف شاخه پسته به فاصله مساوی از آن کشت گردیدند.
-2-4-3 روش مخلوط با محیط کشت: در این روش پس از جمع آوری اسپورها در آب سترون حاوی توئین - 0.05% - Tween 80 درصد، سوسپانسیون اسپور تهیه گردید سپس به روش سری رقت،رقت 5×105 اسپور تهیه گردید. این بار برای هر تشتک پتری مخلوط سوسپانسیون اسپور دو تیپ آمیزشی مختلف مورد استفاده قرار گرفت .[8] در هر سه روش فوق در یک تیمار دیگر با استفاده از قارچکش و لینولئیک اسید به جدایهها استرس وارد گردید. تشتکهای پتری در دمای 30 درجه سانتیگراد تحت شرایط تاریکی و به مدت یک ماه نگهداری شدند .[6]
