بخشی از مقاله
چکیده:
براي اولین بار جمعیت باکتریایی بومی معدن میدوك مورد بررسی مولکولی و میکروبی قرار گرفت. هدف از این تحقیق جداسازي و شناسایی سویه هاي موثر در بیولیچینگ مس از معدن میدوك می باشد. ابتدا نمونه هاي سنگ معدن جمع آوري شده از معدن با اسید سولفوریک تیمار شدند و در محیط هاي کشت 9k در دماي 30 درجه سانتیگراد و180 دور در دقیقه انکوبه شدند. نمونه ها با استفاده از میکروسکوپ نوري و فلورسنت بررسی شدند، پس از اطمینان از رشد باکتري ها در محیط کشت، محتواي ژنومی باکتري ها استخراج شد. براي شناسایی دقیق این باکتري ها در سطح جنس، با استفاده از تکنیک PCR، قطعه ژنی بین توالی هاي مربوط به 16s و 23s ریبوزومی تکثیرشد. که نهایتا سویه باکتریایی تیوباسیلوس فرواکسیدانس از معدن میدوك جداسازي و به طریقه مولکولی شناسایی شد. همچنین نمودار رشد باکتري با استفاده از اندازه گیري میزان تبدیل Fe++ به Fe+++ بدست آورده شد.
واژه هاي کلیدي: بیولیچینگ- محیط کشت -تیوباسیلوس- PCR
-1مقدمه
بیولیچینگ - آبشویه میکروبی - به فرایندي اطلاق می شود که در طی آن با استفاده از میکروارگانیسم ها فلزات از فرم نامحلول - که اکثرا سولفیدي هستند - به فرم محلول - که اکثرا سولفاتی هستند - تبدیل می شوند . - 3 - این روش در مورد فلزاتی همچون مس، کبالت، نیکل، روي و اورانیوم کاربرد دارد. در مورد بازیافت طلا و نقره، آبشویه میکروبی باعث حل شدن سولفید هاي سایر فلزات موجود در کانسنگ ها می شود و در نتیجه به بازیافت فلزات مذکور کمک می کند - . - 4 استفاده از فرایند آبشویه میکروبی نسبت به روش هاي سنتی فیزیکوشیمیایی چندین مزیت دارد. این فرایند با محیط زیست متناسب تر است، انرژي کمتري مصرف می کند، براي سنگ معادنی با عیار پایین بسیار مناسب است و از نظر اقتصادي بسیار به صرفه می باشد - - 3
این فرایند به وسیله گروه هاي متنوعی از باکتري ها صورت می پذیرد که متداول ترین آنها مربوط به جنس تیوباسیلوس1 و لپتوسپیریلوم2 می باشد. این باکتري ها اغلب مزوفیل، اسیدوفیل و شیمیولیتواتوتروف هستند و انرژي خود را از اکسیداسیونیون فرو به فریک و یا از اکسیداسیون ترکیبات گوگردي احیا شده به اسید سولفوریک بدست می آورند - 1و - 2 اولین قدم در توسعه فرایند آبشویه میکروبی در سطح صنعتی، در معادن فلزي، بررسی جمعیت باکتریایی آن است. یکی از مشکلات مهم در مطالعه جمعیت باکتریایی معادن در این است که اصولا باکتري هاي این معادن نیاز هاي متابولیک مشابهی دارند و همین امر جداسازي، شناسایی و بررسی کیفی و کمی آنها را با مشکل مواجه می سازد - . - 1
در فاصله بین 16s و 23s از DNA ریبوزومی ناحیه شدیدا متغیري وجود دارد که در طرفین آن توالی هاي حفظ شده اي قرار دارد. پرایمر هاي مربوط به این تحقیق بر اساس همین توالی هاي حفظ شده طراحی شده است. البته قطعات دیگري مثل16s یا 23s ریبوزومی نیز توسط محققان براي شناسایی باکتري ها و بررسی فیلوژنی آنها مورد تکثیر و تعیین توالی قرار گرفته اند اما مزیتی که قطعه 16s-23s نسبت به توالی هاي فوق دارد این است که تنوع در این ناحیه در بین سویه هاي مختلف بیشتر است و بر اساس این توالی باکتري هاي اختصاصی تري قابل شناسایی هستند - - 5
-2 مواد و روش ها
2-1 شرایط کشت
محیط کشت مورد استفاده براي جداسازي باکتري ها محیط کشت 9k با ترکیب زیر بود :K2HPO4 - 0.4gr - , CaNO3 - 0.01gr - , MgSO4.7H2O - 0 .4gr - , - NH4 - 2SO4 - 0.4gr - PH:1.5-2, .FeSO4.7H2O - 33.3gr - نمونه هاي سنگ معدن که به مدت 3 هفته با اسید سولفوریک 1 نرمال تیمار شده بودند بهذرات ریز خرد شده و 5 گرم از نمونه در 200 میلی لیتر محیط کشت 9K و در دماي 30 درجه سانتیگراد اینکوبه شد. نمونه ها پس از تغییر رنگ محیط کشت تحت بررسی میکروسکوپی قرار گرفتند.
-2-2 استخراج DNA و واکنش زنجیره اي تکثیر
رسوب حاصل از 200 میلی لیتر محیط کشت باکتري با بافر TE شستشو داده شد واستخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA - شرکت سیناژن - انجام شد. از 1/5 نانوگرم DNA کروموزومی و پرایمرهاي 27Fو1492R براي انجام واکنش زنجیره اي تکثیر استفاده شد. شرایط PCR به صورت 30 چرخه 94 درجه سانتیگراد - 15 ثانیه - ، 55 درجه سانتیگراد1 - دقیقه - و 72 درجه سانتیگراد - 30 ثانیه - بهینه شد.
2-3 تعیین توالی
پس از الکتروفورز محصول PCR و تایید باند مربوط به سویه جدا سازي شده محصول PCR به وسیله دستگاه اتوماتیک سکانسینگ 3700ABI - شرکت ماکروژن کره - تعیین توالی شد.
2-4 بررسی روند رشد
براي بررسی روند رشد بر مبناي میزان تبدیل Fe++ به Fe+++ ابتدا نمونه باکتریایی در محیط کشت 9k کشت داده شدند وتوسط تکنیک اسپکتروفتومتري نمودار رشد آنها بدست آورده شد.
-3 نتایج
بعد از 8 هفته گرماگذاري نمونه هاي سنگ معدن میدوك در محیط کشت 9K یک سویه جدید از این معدن جداسازي شد. نمونه ها با میکروسکوپ نوري و فلورسنت بررسی شدند. - شکل 1و. - 2
نتایج میکروسکوپی و شرایط سخت محیط کشت - PH پایین - دلالت بر این امر داشت که سویه مذکور باید اسیدو تیوباسیلوس باشد. در مرحله بعد روش PCR به کار گرفته شد و بهینه شد. PCR براي فاصله بین ژن هاي 16s و 23s ریبوزومی باکتري فوق الذکر استفاده شدنتایج PCR نشان داد که قطعه1434 زوج بازي در مورد باکتري باکتري تازه جداسازي شده تکثیر شده است. نمونه ها براي تعیین توالی ارسال شد، مقایسه توالی بین 16s و 23s باکتري تازه جداسازي شده با اطلاعات بانک ژنی نشان داد که این باکتري از جنس تیوباسیلوس فرواکسیدانس3 می باشد. به منظور بررسی میزان رشد باکتري مذکور میزان تولید آهنIII این باکتري مورد بررسی قرار گرفت - نمودار - 1
