بخشی از مقاله
چکیده
زیر واحد بتا - LTB - توکسین حساس به حرارت انتروتوکسیژنیک اشریشیا کولی یک ایمونوژن قوي بوده و به عنوان کاندید واکسن مطالعات زیادي روي آن انجام می شود. این مطالعه با هدف ساخت یک واکسن برپایه سالمونلا به عنوان ناقل زنده براي بیان LTB در داخل بدن تحت یک پروموتر tac تغییر یافته و ارزیابی پاسخ آنتی بادي به دنبال ایمن سازي از طریق بینی انجام شد. یک پلاسمید جدید، pFStacLTB50 ، براي بیان مداوم ژن LTB تحت کنترل پروموتر tac اصلاح شده ساخته شد.
این پلاسمید بداخل سویه واکسن سالمونلا تیفی موریوم PhoPc الکتروپوریت شد و میزان بیان rLTB بررسی شد. این واکسن جهت ایمونیزاسیون از طریق بینی بکار رفت. این واکسن توانست پروتئین LTB را در حضور و عدم حضور القا کننده بیان کند. پاسخ آنتی بادي به دنبال اولین دوز واکسن در همه موش هاي ایمن شده ظاهر شد و به دنبال دوزهاي یاداور این پاسخ در برخی از آنها افزایش یافت. این نتایج نشان داد تجویز این واکسن از طریق بینی در in vivo قادر به بیان پروتئین نوترکیب در سطح مطلوب براي تحریک سیستم ایمنی هومورال می باشد.
مقدمه:
انتروتوکسیژنیک اشریشیا کولی Enterotoxigenic Escherichia coli - ETEC - یکی ازعوامل مهم اسهال در کودکان در کشورهاي در حال توسعه می باشد.4 توکسین حساس به حرارت LT از مهم ترین عوامل بیماریزائی این ارگانیسم بوده که از دو زیرواحد LTA و LTB تشکیل شده است. LTA بخش توکسیک این توکسین راتشکیل می دهد در حالیکه LTB که در اتصال به گیرنده هاي گانگلیوزید GM1 در سطح سلول هاي یوکاریوتیک نقش دارد یک ایمونوژن قوي بوده و به عنوان کاندید واکسن مطالعات زیادي روي آن انجام می شود.
گونه هاي ضعیف شده ژنتیکی سالمونلا که قدرت تهاجم به بافت ها را حفظ کرده بدون اینکه بیماري ایجاد نمایند اساس Live attenuated salmonella-based vaccine را تشکیل میدهند. سالمونلاي ضعیف شده به عنوان حامل ژن هاي بیگانه طی تهاجم محدود خود به بافت ها قادر به بیان آنتی ژنهاي بیگانه و عرضه آن به سیستم ایمنی میزبان می باشد. این مطالعه با هدف ساخت یک واکسن زنده برپایه سالمونلا براي بیان LTB تحت پروموترtac مدیفیه شده جهت بیان مداوم LTB و ارزیابی پاسخ آنتی بادي به دنبال ایمن سازي موش از طریق بینی انجام شد
مواد و روشها :
ابتدا ژن LTB آمپلیفیه و سپس در یک پلاسمید مشتق از pKK223 کلون شد در این پلاسمید - هدیه از CHUV, Swiss - پروموتر tac توسط Florian Schoudel به صورتی تغییر یافته است که بتواند بدون القاي شیمیایی توسط IPTG قادر به تولید 10برابر ژن مورد نظر باشد.3 کلونینگ در این پلاسمید از طریق جایگاههاي آنزیمی NcoI/HindII و ترانسفورمیشن به DH5a E.coli صورت گرفت. از کلونهاي متعدد پلاسمید هاي تخلیص شده و پس از restriction analysis ، یک پلاسمید انتخاب و بنام pFStacLTB50 خوانده شد.
این پلاسمید سپس از طریق الکتروپوریشن به باکتري - salmonella - Phopc منتقل گردید. از کشت شبانه سویه هاي E.coli یا salmonella - Phopc - واجد پلاسمید نوترکیب به محیط هاي LB حاوي آمپی سیلین تلقیح شد در مرحله رشد نیمه لگاریتمی یک گروه از کشت ها بدون القا و در گروه دیگر القا با اضافه کردن IPTG - 0.4 mM - انجام شد و رشد باکتري 4 ساعت ادامه یافت. پس از تعیین cfu/ml رسوب باکتریها جدا و لیز شد.
مایع حاصل از لیز باکتري و همجنین سوپ محیط کشت جهت ارزیابی پروتئین نوترکیب بکار رفت. میزان LTB در هر نمونه براساس یک منحنی استاندارد کالیبراسیون از رقت سریال توکسین استاندارد - سیگما - اندازه گیري شد و بر اساس تعداد باکتري تعیین شده در هر نمونه میزان بیان به ازاي 109 cfu محاسبه گردید به منظور ارزیابی ساختار مولکول LTB نوترکیب از نظر قابلیت اتصال به رستپور خود - گانگلیوزید - و حفظ شاخص هاي آنتی ژنتیک و همچنین اندازه گیري میزان بیان پروتئن و نیز سنجش آنتی بادي سرم ساندویچ gangliosid GM1 ELISA طراحی گردید.
الف: براي نشان دادن بیان پروتئن نوترکیب حفره هاي پلیت الیزا با gangliosid GMI type III پوشانده و پس ازشستشو، با BSA بلوك شد. رقت هایی از مایع حاصل از لیز باکتري و سوپ محیط جهت تعیین میزان بیان به حفره هاي جداگانه اضافه شد از آنتی بادي منوکلونال - D15-8 هدیه از انستیتو پاستور پاریس - ، به عنوان اولین آنتی بادي و ازآنتی آنتی بادي موش کونژوگه با پرکسیداز به عنوان آنتی بادي ثانوي استفاده شد سوبستراي رنگ زاي TMB در حضور H2O2 جهت ظهور واکنش بکار رفت نتایج پس از 15 دقیقه با خواندن جذب در طول موج 450 نانومتر تعیین و میزان بیان بر اساس منحنی کالیبراسیون توکسین استاندارد تعیین شد.
ب: براي سنجش تیتر آنتی بادي مانند مرحله قبل حفره ها با gangliosid GMI پوشانده و با BSA بلوك شد به حفره ها غلظت معینی از LT استاندارد اضافه و پس از انکوباسیون و شستشوي حفره ها رقت سریال از سرم ها اضافه میگردد و از آنتی بادي مونوکلونال به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. بقیه مراحل مطابق روش بالا انجام میگیرد ایمونیزاسیون موش از طریق بینی nasal با سویه واکسن : سالمونلا واجد پلاسمید نوترکیب phoPc/pFStacLTB به عنوان سویه واکسن و سویه PhoPc به عنوان کنترل استفاده شد.
سویه هاي واکسن و کنترل در محیط LB کشت و تا مرحله نیمه لگاریتمی انکوباسیون ادامه یافت. سپس باکتري جدا و در PBS سوسپانسیون گردید. واکسیناسیون درگروههاي 8 تایی از موش هاي BaLb/C ماده 4-8 هفته اي با وزن حدود 18-20 گرم انجام شد. با تلقیح 20 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتري زنده واجد 107-109 cfu در حفره راست بینی و در روزهاي 1 و 14 و 28 انجام شد. خون گیري یک روز قبل از هر ایمونیزاسیون و دو هفته پس از آخرین دوز واکسن انجام شد. از نمونه هاي خون سرم جدا و جهت تعیین تیر آنتی بادي ضد LTB به روش GM1ELISA استفاده شد.
نتایج
ژن آمپلیفیه شده LTB از جایگاههاي آنزیمی NcoI/HindII تحت پروموتر تغییر یافته tac کلون شد و پلاسمید ساخته شده بنام pFStacLTB50 نامگذاري شد restriction analysis ساختار مورد انتظار و صحیح این پلاسمید را نشان داد. بررسی E. coli /pFStacLTB50 و PhoPc/ pFStacLTB50 از نظر بیان rLTB در شرایط in vitro نشان داد که rLTB تحت پروموتر tac اصلاح شده در حضور یا عدم حضور القا کننده IPTG قادر به بیان پروتئین نوترکیب می باشد و بخشی از این پروتئین به محیط کشت نیز ترشح میشود.
نتایج نشان داد که هم در E. coli و هم در PhoPc این پروموتر بدون نیاز به IPTG نیز بطور مداوم فعال است هر چند میزان بیان در شرایط القائی نسبت به حالت مداوم در 3/7 E.coli برابر و در1/5 PhoPcبرابر می باشد. علاوه بر این پروتئین در همه شرایط درمایع محیط کشت نیز وارد میشودهر چند این میزان از 3/8 تا 27/8 برابر کمتر از پلت باکتري است.در مجموع میزان بیان چه در حالت القایی و چه در حالت مداوم در PhoPc بالاتر است اما میزان ترشح پروتئین نوترکیب در محیط کشت در دو میزبان تفاوت محسوسی ندارد. ایمنی زایی از طریق بینی توسط سویه واکسن PhoPc/pFStacLTB نشان داد این پروتئین در شرایط in vivo نیز بیان می شود به نحوي که قادر به تحریک سیستم ایمنی و ایجاد آنتی بادي می باشد. نتایج حاصل در نمودار 1 امده است
بحث:
در واقع واکسن هاي بر پایه سالمونلا Salmonella-based live vaccine واکسنهاي نسل جدیدي هستند که به دلیل ارزان بودن، عدم نیاز به تخلیص پروتئین - که با از دست رفتن و دناتوره شدن پروتئین همراه است - ، عدم نیاز به زنجیره سرد انتقال واکسن ، تحریک پاسخ ایمنی مخاطی و سلولی علاوه بر ایمنی هومورال ، تجویز واکسن از طریق مخاطات - خوراکی ، بینی - و عدم نیاز به سورنگ و همچنین امکان تولید واکسنهاي چند گانه مورد مطالعه و کارآزمایی بالینی هستند. تجویز از طریق بینی که در این مطالعه نیز انجام شد میتواند سویه واکسن زنده را به NALT عرضه نموده و مشکل آسیب واکسن در هنگام عبور از سد اسید معده بر طرف سازد.
Salmonella typhimurium phoPc سویه نوترکیبی است که با ایجاد موتاسیون در سسستم تنظیمی دو تایی phoP-phoQ که به کاهش بقاي سالمونلا در ماکروفاژها منجر شده است به عنوان یک حامل زنده واکسن بطور گسترده تحت بررسی است و داراي اثرات منحصر به فردي در تهیه واکسن هایی علیه برخی ویروس ها مثل HPV نیز می باشد1و.3 پروموترهاي القائی معمول نظیر lac, trc,tac, که توسط IPTG القا میشوند در شرایط in vivo جایی که القا کننده IPTG وجود ندارد قابل کنترل نیستند بر همین اساس در این مطالعه استفاده از پروموتر tac اصلاح شده نشان داد که این پروموتر با وجود حساسیت نسبت به القا کننده در عدم حضور آن نیز بطور مداوم فعال است.
این واکسن توانست در شرایطin vitro پروتئین LTB را با دو ویژگی اساسی شامل اتصال به رسپتور اختصاصی و حفظ شاخص هاي ایمونولوژیک خود در سطح بالا تولید کند. القا پاسخ آنتی بادي به دنبال اولین دوز واکسن در همه موش هاي ایمن شده و افزایش پاسخ پس از دوز هاي یاد اور نشان دهنده فعالیت این پروموتر در شرایط in vivo و بیان پروتئین rLTB در سطح مطلوب براي تحریک سیستم ایمنی می باشد. این نتایج نشان داد واکسن S. typhimurium PhoPc/ pFStacLTB از طریق بینی در مدل حیوانی می تواند به القا پاسخ ایمنی هومورال علیه توکسین حساس به حرارت ETEC منجر شود.
