بخشی از مقاله
چکیده
روش هاي مرسوم در شناسایی باکتري هاي عفونت زا موجود در ادرار انسان عمدتاً زمان بر و مستلزم هزینه هاي گزاف هستند. مطمئن ترین روش شناسایی عفونت هاي دستگاه ادراري، کشت نمونه ادرار بوده و حداقل 48 ساعت زمان براي تشخیص عوامل عفونت زا نیاز دارد. تشخیص سریع، ساده و دقیق وجود باکتري ها در ادرار حائز اهمیت بوده و سبب شناسایی به موقع بیماري و درمان آن می گردد. در این پژوهش از تغییر حاصل در میزان ضریب دي الکتریک نمونه ي ادرار ناشی ا ز تغییرات غلظت باکتري هاي عفونت زا جهت شناسایی تعداد باکتري ها در ادرار بهره گرفته شده است. در این روش مدت زمان تشخیص به حدود یک ساعت تقلیل یافته است. به منظور امپدانس متري، سامانه اندازه گیري مناسبی تهیه گردید.
-1 مقدمه
عفونت مجراي ادراري - UTI - به عنوان دومین عامل عفونت در انسان شناخته شده است و سالانه 150 میلیون نفر را در سراسر دنیا گرفتار می کند همچنین هزینه هاي بهداشتی سالیانه آن بسیار زیاد است و در تمام گروه هاي سنی رخ می دهد 2]،.[1 به تعداد حداقل 105 باکتري در هر میلی لیتر ادرار ، عفونت ادراري گفته می شود .[3] عفونت حاد ادراري از نظر آناتومیک به دو گروه تقسیم می شود: عفونت مجاري تحتانی - عفونت حاد مثانه و عفونت پیشابراه - ، عفونت مجاري فوقانی - پیلونفریت حاد ، آبسه هاي داخل و اطراف کلیه - می باشد.[1]
باکتري هاي که منجر به عفونت هاي دستگاه ادراري شده شامل باکتري هاي گرم منفی شامل اعضاي خانواده ي انتروباکتریاسه ها، سودوموناس ها و باکتري هاي گرم مثبت شامل انتروکوکوس، استافیلوکوکوس و تعدادي از قارچ ها و ویروس ها هستند .[4] سایر میکرو ارگانیسم ها با شیوع کمتر شامل سالمونلا، کاندیدیا، کورینه باکتریوم اورولیتیکوم می باشند. البته احتمال ایجاد عفونت توسط پاتوژن هاي غیر متداول هم چون مایکلاسما هومونیس ، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یا ویروس هاي BK و JC نیز وجود دارد.[5]
بیش از % 80 از عفونت هاي مجاري ادراري توسط باسیل هاي گرم منفی ایجاد می شود که شایع ترین آنها اشریشیا کلی می باشد.[6] عدم تشخیص و درمان به موقع عفونت ادراري می تواند عوارض شدیدي هم چون اختلالات دستگاه ادراري، فشار خون، اختلالات کلیوي، اورمی و در زنان حامله عامل زایمان زودرس و حتی سقط جنین را موجب می شود.[5 ] یکی از مهمترین و بهترین و دقیق ترین راه هاي تشخیص عفونت، آزمایش ادرار و کشت آن می باشد. به این صورت که میزان خیلی کمی از ادرار روي محیط استریل کشت داده می شود و پس از 24 الی 48 ساعت مورد بررسی قرار می گیرد.
کشت ادرار در صورتی مثبت است که تعداد کلنی هاي باکتریایی بزرگتر و یا مساوي 105 واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلی لیتر - - CFU/ml ارگانیسم متداول در دستگاه ادراري باشد. در موارد مشخص تنها بر اساس علائم، تشخیص و درمان صورت می گیرد. در موارد پیچیده تائید تشخیص از طریق آنالیز ادرار و جستجو به دنبال حضور نیتریت در ادرار، سلول هاي سفید خون، و یا لکوسیت استراز مفید می باشد. یکی دیگر از آزمایش هاي تشخیصی عفونت ادراري، بخش میکروسکوپی است که به دنبال حضور سلول هاي قرمز خون، سلول هاي سفید خون، و یا باکتري می گردد.[7]
باکتري اشریشیا کلی که رایج ترین نوع از باکتري عفونت زا می باشد داراي ابعاد 2-1 میکرومتر هست. با توجه به ساختار آناتومی باکتري که عمدتاً از 12 درصد آب - یا مایع دیگر - تشکیل شده است، افزایش جمعیت آن در ادرار، ضریب دي الکتریک سوسپانسیون را تحت تاثیر قرار خواهد داد . بر این اساس چنانچه سایر املاح از ادرار جدا شد و صرفا مایع حاوي باکتري هاي احتمالی تهیه گردد، می تو ان با اندازه گیري ضریب دي الکتریک آن، به ارزیابی آماري باکتري ها پرداخت. بر این اساس در این مقاله، روش خازن سنجی به منظور تشخیص عفونت ادراري مورد بررسی قرار گرفته است در ادامه به معرفی سامانه ي اندازه گیري امپدانس متري طراحی شده و نتایج حاصله پرداخته شده است.
تئوري و پیشینه تحقیق
باکتري ها یک گروه بزرگ و پراهمیت از میکروارگانیسم هاي تک سلولی هستند. تشخیص سریع و دقیق عفونت باکتریایی این امکان را فراهم می آورد تا در عین حا ل که تشخیص سریع را می تواند تضمین کند که درمان هرچه زودتر انجام شود، نیز مناسب ترین درمان شناسایی شود. یکی از مهم ترین، بهترین و دقیق ترین راه هاي تشخیص عفونت، آزمایش ادرار و کشت آن می باشد و نیز روش هاي جدید دیگري براي تشخیص باکتري ها از نمونه هاي بالینی مانند آنزیم ﻣﺮﺗﺒﻂ آزمایش ایمونوسوربنت - ELISA1 - ، واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR2 - ، آنالیز فلورسانس، تشخیص جریان سیتومتري و روش هاي ایمونولوژیکی، که متاسفانه تمامی آنها محدودیت هاي قابل ملاحظه اي برحسب زمان، هزینه و پیچیدگی دارند. بررسی روش شمارش باکتري ها با توجه به صرفه جویی در زمان و کاهش هزینه اهمیت زیادي دارد.
Zhihua و همکاران در سال 2016 در چین بر روي شمارش باکتري براساس فیلم نازك پلی آنیلین - PANI - مطالعه اي انجام دادند. پلی آنیلین - PANI - ، به عنوان یکی از مهم ترین پلیمرها، با توجه به هزینه کم، ثبات محیطی خوب، انعطاف پذیري و خواص نوري و برقی قابل توجه، توجه زیادي را به خود جلب کرده است. PANI می تواند به راحتی با روش هاي الکتروشیمیایی و اکسیداسیون شیمیایی سنتز شود. در مطالعه انجام شده، فیلم نازك PANI بر روي یک الکترود کربن شیشه اي - GCE3 - از طریق پلیمریزاسیون الکتروشیمیایی، ثابت شده است که در نتیجه بی حرکت شدن باکتري ها بر روي سطح GCE با شکل گیري فیلم PANI مواجه می شوند. بر اساس این پدیده جالب، یک روش جدید براي شمارش باکتري بر اساس فیلم نازك پلی آنیلین توسعه یافته است، که داراي مزایاي فراوان از جمله صرفه جویی در زمان، هزینه کم و کاربرد آسان است8]و.[9
Lu و همکاران در سال 2008 در تایوان مطالعه اي بر روي استفاده از بیوسنسورها که یک روش جایگزین براي تشخیص باکتري است انجام دادند. بیوسنسورها ترکیبی از مکانیسم هاي تشخیصی بیولوژیکی با تکنیک انتقال فیزیکی می باشد. انتقال بیوسنسور می تواند میکرومکانیکی، الکتروشیمیایی، پیزوالکتریکی، گرمایی، مغناطیسی یا نوري باشد. در میان این روش ها، روش هاي انتقال الکتروشیمیایی همانند آمپرومتري، Impedimetry ، پتانسیومتري بسیار کم هزینه تر و حساس تر از تکنیک هاي دیگر هستند. رویکردهاي متفاوت براي شناسایی باکتري ها بر اساس سیستم هاي الکترومکانیکی وجود دارد10]و.[11
معمولاً حساسیت استفاده از رویکرد Impedimetry می تواند تا 107-104 CFU/ml در کشت خالص به مدت 5 min براساس تشخیص E.Coli O157H7 با اندازه گیري امپدانس باکتري در فرکانس هاي متفاوت 100Hz - تا - 10MHz و باکتري ساکن روي SiO2 پایین باشد. ترکیب رویکرد بالا با استفاده از ذرات مغناطیسی هم بررسی شده است. رویکرد دیگر براي داشتن سطح حساسیت بالاتر و زمان شناسایی پایین تر ، اندازه گیري کاهش مقاومت ناشی از انتقال الکترون تسهیل شده به وسیله آنتی بادي پلی آنیلین بر چسب دار بین الکترودها تسهیل است. نتایج نشان می دهند این رویکرد نشان دهنده ي حساسیت از توانایی تشخیص در مورد 81 CFU/ml در 6 min یا 79 CFU/ml در 10 min می باشد10]و.[11
در این جا رویکردي را معرفی می کنیم که در آن شناسایی باکتري با درجه بندي مشارکت الکتریکی باکتري تک، E.Coli ، صورت می گیرد و با استفاده از الگوهاي آزمایش تشکیل شده از اتصال آرایش هاي الکترودي Au با آنتی بادي اصلاح شده است. با توجه به گزارش هاي قبلی در مورد سنجش امپدانس باکتري ها، در فرکانس هاي متفاوت ب ه وسیله بی حرکت کردن باکتري هاي روي SiO2 ، ترکیب آن با استفاده از ذره مغناطیسی و یا پیاده سازي آنتی بادي علامت دار پلی آنیلین صورت می گیرد و در این روش از رویکردي استفاده می شود که مشارکت کنونی باکتري هاي بی حرکت شده روي دو الکترود مجاور Au بررسی می شود و با این روش می توان امکان استفاده از این رویکرد را براي کاربردهاي آینده در زمان واقعی، خاص و شناسایی باکتریایی کمی تا سلول باکتریایی تک به کار برد10]و.[11
مواد و روش ها
به منظور امپدانس متري و تشخیص وجود با کتري هاي عفونی، کار آزمایشگاهی به دو بخش تهیه سوسپانسیون میکروبی استاندارد و سامانه ي مناسب جهت اندازه گیري ظرفیت خازنی ناشی از تغییر غلظت باکتري هاي عفونی تقسیم شده است.
تهیه سوسپانسیون میکروبی
هدف از انجام این کار ایجاد یک غلظت یکنواخت براي آماده سازي ن مونه ها ي میکروبی مورد نظر در رقت هاي مختلف می باشد. در این روش سوش استاندارد اشریشیا کلی - ATCC 25922 - به صورت ویال هاي لیوفیلیزه از کلکسیون قارچ ها و باکتري هاي ایران خریداري گردید. در شرایط استریل پودر لیوفیلیزه به 2 cc از محیط آبگوشت" "BHI - Brain Heart Infusion - Broth acc.ISO 6888 GranuCult - PN: 1.10493.0500 - منتقل شده و به مدت 48 ساعت در دماي 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد. در مرحله بعد با استفاده از کشت مادر رشد یافته، کشت ذخیره تهیه گردید. براي انجام این روش 8 لوله آزمایش در بسته که لوله اول حاوي 8 cc آب
