بخشی از مقاله
چکیده:
گیاهان به مکانیزم هاي سلولی مختلفی در مقاومت با اثر سمی فلزات سنگین مجهز شده اند. یکی از مهمترین این مکانیزمها، کلاته شدن فلزات توسط لیگاندهایی با میل ترکیبی بالاست. فیتوکلاتینها - PCs - 1 و متالوتیونینها - MTs - 2 کلاته کنندههاي پروتئینی درون سلولی و غنی از آمینواسیدهاي سیستئین - Cys - هستند که نقش مهمی را در خارج کردن فلزات از دسترس سلولهاي گیاهی ایفا میکنند.
MT ها پروتئینهایی با وزن مولکولی کم 5 - تا 10 کیلودالتون - هستند که میتوانند از طریق گروه تیول آمینو اسیدهاي Cys خود به فلزات متصل شوند. در این مطالعه به منظور مقایسه نقش دو ایزوفرم مختلفMT، توالی هاي کد کنندهي دو ژن OsMTI و OsMTII از گیاه برنج در ناقل بیانی pET41a به همراه شریک الحاقی GST همسانه سازي شد و به میزبان بیانی E. coli سویه ي Rosetta - DE3 - منتقل شدند.
مقدار قابل توجهی از فرم نوترکیب هر دو ایزوفرم در فاز محلول پس از القا محیط کشت با IPTG تولید شد. به منظور مقایسه نقش اختصاصی این دو ایزوفرم سلول هاي باکتري بیان کنندهي پروتئینهاي نوترکیب در محیط LB حاوي هر یک از نمکهاي CuSo4، ZnSo4، CdCl2، NiCl2 رشد داده و منحنی رشد آنها در مقایسه با شاهد ترسیم شد. در حالیکه بیان پروتئین نوترکیب GST- OsMTI موجب ایجاد مقاومت سلولهاي باکتري به فلزات کادمیوم، روي و نیکل شد، بیان نوترکیبGST-OsMTII مقاومت ناچیزي را در برابر فلز روي و نیکل ایجاد نمود. این نتایج میتواند دلیلی بر نقش متفاوت این دو ایزوفرم در گیاه برنج باشد.
مقدمه:
امروزه آلودگی فلزات سنگین در خاك ، یک مشکل عمده زیست محیطی محسوب می شود و بر سلامت انسان، موجودات زنده، تولیدات کشاورزي و زیست بوم اثر دارد. دوام بلند مدت بیولوژیکی و باقی ماندن این فلزات در خاك، سبب انباشته شدن آنها در زنجیره غذایی و در نتیجه تأثیرات منفی بالقوه براي سلامتی انسان می گردد .
اگر چه بسیاري از فلزات براي گیاهان لازم و ضروري اند اما غلظتهاي بالاي این فلزات براي گیاهان سمی است زیرا باعث ایجاد تنش اکسیداتیو1 در گیاه و در نتیجه تولید رادیکالهاي آزاد می شوند. در غلظتهاي بالا، فلزات سنگین با فلزات ضروري جایگزین می شوند. گیاهان به منظور استفاده از فلزات و جلوگیري از سمیت آنها مکانیزمهاي مختلفی را توسعه دادهاند. یکی از مهمترین این مکانیزمها، کلاته شدن فلزات توسط لیگاندهایی با میل ترکیبی بالاست. کلاته کنندههاي درونسلولی و غنی از آمینواسیدهاي سیستئین - Cys - ، شامل فیتوکلاتینها - PCs - 2 و متالوتیونینها - MTs - 3 نقش مهمی را در این زمینه ایفا میکنند
MTها گروهی از پروتئینهاي غنی از Cys و با وزن مولکولی کم 5 - تا 10 کیلودالتون - هستند که اولین بار در سال 1957 به عنوان پروتئینهاي متصل شده به کادمیوم از کلیه ي اسب جدا شدند . - 5 - از آن زمان تعداد زیادي ژن MT از موجودات مختلف از جمله حیوانات، گیاهان عالی، قارچها و برخی پروکاریوتها مثل سیانوباکتريها جداسازي شد. MTهادر گیاهان بر اساس الگوي توزیع آمینو اسیدهاي Cys در دو کلاس I و II قرار می گیرند.
مشخصه ي کلاس I ، که اکثر ژنهاي کدکننده MT گیاهی درآن قرار دارند، وجود دو دمین غنی از Cys در دو انتهاي N- و C- پروتئین است که توسط یک ناحیه فاصله انداز4 عاري از Cys به طول 30-40 آمینواسید از هم جدا میشوند. در کلاس II آمینو اسیدهايCysدر سه دمین و عمدتاً به صورت موتیف هاي X - C-X-C هر آمینو اسیدي به غیر از - Cys پراکنده اند که هرکدام توسط فاصله اندازهایی با طول 10-15 آمینواسید از هم جدا می شوند . - 7 - در ژنوم گیاه برنج بیش از 10 ژن کد کننده MT متعلق به کلاس I وجود دارد که در چهار تیپ مختلف دسته بندي می شوند. ژنهاي کلاس II نیز در تعدادي از گیاهان از جمله برنج شناسایی شده اند. وجود ایزوفرمهاي مختلف ازMT در گیاهان نشان دهنده اهمیت نقش این پروتئینها میباشد.
در مقایسه با MT در جانوران نقش MT ها در گیاهان به میزان محدودتري مورد مطالعه قرار گرفته است.مخصوصاً علت وجود تعداد زیادي از ایزوفرم MT در گیاهان و نقش اختصاصی هر یک از آنها به طور واضح تاکنون مشخص نشده است.
بیشترین اطلاعات ما در مورد MTهاي گیاهی مربوط به آنالیز بیان ژنهاي کد کننده MT در پاسخ به عناصر فلزي مختلف و یا در پاسخ به تیمار استرسهاي محیطی میباشد. با این حال به نظر می رسد استفاده از روشهاي مبتنی بر مهندسی ژنتیک وانجام آزمایشات تکمیلی با استفاده از انتقال هر یک از ژنهاي کد کننده MT ي گیاهی به موتانتهاي حساسی از مخمر و باکتري بتواند راهکار مناسبی را براي بررسی عملکرد ژنهاي مرتبط با هومئوستازي فلزات ایجاد نماید و اطلاعات تازه اي را در رابطه با تعیین وظایف ایزوفرمهاي مختلف MT در واکنش با فلزات فراهم نماید. این تحقیق با هدف بررسی نقش دو ایزوفرم OsMTIو OsMTII از گیاه برنج، که به ترتیب به کلاس هاي I و II تعلق دارند، بر میزان مقاومت سلولهاي باکتري E. coli به فلزات سنگین انجام شده است.
مواد و روشها:
- ساخت ناقل بیانی
توالی کد کننده ي دو ژن OsMTI و OsMTII گیاه برنج از پایگاه اطلاعاتی Rice genome annotation به دست آمد. جایگاه آنزیمهاي برشی HindIII و EcoRI در دو انتهاي توالیها تعبیه شد و توالیهاي حاصل توسط شرکت GenScript
در پلاسمید puc57 سنتز شد. پس از برش قطعات ORF توسط آنزیمهاي برشی، این قطعات در ناقل بیانی pET41a داراي توالی شریک الحاقی GST، همسانه سازي شدند. صحت توالیها از طریق توالی یابی مورد تأیید قرار گرفت. پلاسمیدهاي نوترکیب حاصل به منظور بیان پروتئین به میزبان بیانی E. coli سویه Rosetta - DE3 - منتقل شدند.
- رشد سلول هاي باکتري و بیان پروتئین الحاقی نوترکیب - GST-MT -
به 80 میلی لیتر محیط LB مایع جدید به همراه آنتی بیوتیک هاي کلرامفنیکل و کانامایسین، 5 میلی لیتر از کشتهاي شبانه سلولهاي باکتري ترانسفورم شده با پلاسمید pET41a تنها و هم چنین پلاسمیدهاي نوترکیب اضافه شد . سلولها در دماي 37 درجه سلسیوس با سرعت شیکر 180 دور در دقیقه رشد یافتند. هنگامی که OD600nm به 0.8-0.6 رسید ، IPTGبه غلظت نهایی 0.1 میلی مولار به کشتها اضافه شد.
در فواصل زمانی مختلف نمونهبرداري از سوسپانسیون باکتري در لولههاي اپندورف 1/5 میلی لیتري صورت گرفت. لولهها به مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دماي 4 درجه سلسیوس سانتریفوژ گردیدند و سپس محلول رویی لولهها دور ریخته و رسوب حاصل در 200 میکرولیتر ازبافر mM - TE 10Tris-HCl، - 1mM EDTA pH 8 سوسپانسیون شد. دیواره سلولهاي باکتري با استفاده از روش سونیکیشن با دامنهي امواج%1001 و چرخهي% 60 2 تخریب شد و پس از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در 12000 دور در دقیقه در دماي 4 درجه سلسیوس، فاز رویی براي بررسی میزان بیان پروتئینهاي محلول بر روي ژل آگارز %12 بارگذاري گردیدند.
- بررسی میزان مقاومت سلولهاي بیان کننده پروتئینهاي نوترکیب به فلزات سنگین
به منظور بررسی اثر بیان دو ژن OsMTI و OsMTII بر مقاومت سلولهاي باکتري به فلزات سنگین، ابتدا حداقل غلظت بازدارنده ي رشد - MIC3 - نمکهاي CuSo4، ZnSo4، CdCl2، NiCl2 براي سلولهاي حاوي پلاسمید pET41a تنها اندازه گیري شد. سپس غلظتهاي مناسب براي بررسی میزان مقاومت سلولهاي حاوي پلاسمید حامل ژنهاي OsMTI و OsMTII انتخاب شدند . پنچ میلی لیتر از کشت شبانه به 80 میلی لیتر محیط LB جدید به همراه آنتی بیوتیکهاي کلرامفنیکل و کانامایسین تلقیح شد.
سلولهاي باکتري در دماي 37 درجه سلسیوس با سرعت شیکر 180 دور در دقیقه رشد یافتند و هنگامی که OD600nm به 0.8-0.6 رسید ،IPTG به غلظت نهایی 0.1 میلی مولار به کشتها اضافه شد. سپس غلظت 2 میلی مولار CuSo4، 1 میلی مولار ZnSo4، 0.9 میلی مولار CdCl2 و 2.5 میلی مولار NiCl2 به محیطهاي کشت اضافه شد و منحنی رشد باکتريها از طریق اندازه گیري جذب نوري در طول موج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتر رسم و اندازه گیري شد.
نتیجه و بحث:
بررسی میزان بیان پروتئینهاي GST، GST-OsMTI و GST-OsMTII توسط ژل SDS-PAGE ، نشان داد که این پروتئینهادر دماي 37 درجه سلسیوس و مصرف 0.1 میلی مولار IPTG بیان بالایی دارند. استخراج پروتئینهاي تولید شده توسط روش سونیکیشن موجب قرارگیري قسمت عمده ي این پروتئینها در فاز محلول شد
