بخشی از مقاله
چکیده:
آفلاتوکسین از جمله سموم خطرناک قارچی است که دارای اثرات سمی بر سیستم عصبی، سیستم ایمنی، ایجاد جهش ژنتیکی، نقص در جنین و سرطانزایی می باشد. این سم قادر است سبب آلودگی مواد غذایی از جمله کشمش گردد. در این پژوهش، ایزولههای قارچی جدا شده از نمونه-های کشمش خراسان رضوی - پلویی، پیکامی و تیفی - ، با استفاده از روش مولکولی Multiplex PCR به منظور شناسایی قارچهای مولّد آفلاتوکسین مورد ارزیابی قرار گرفت.
همچنین 45 نمونه کشمش، به لحاظ حضور DNA قارچهای تولید کننده آفلاتوکسین بررسی گردید. از میان 50 ایزوله قارچی جدا شده از نمونههای کشمش، تنها دو نمونه باندهای مربوط به تکثیر ژنهای دخیل در مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین را نشان داد. این در حالی است که در هیج یک از نمونههای کشمش باندهای مربوط به ژنهای مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین مشاهده نشد. نتایج حاصل از اندازه گیری میزان آفلاتوکسین به روش HPLC نتایج روش مولکولی را تایید کرد به طوری که هیچیک از نمونههای کشمش آلوده به سم آفلاتوکسین نبود.
مقدمه:
کشمش میوه خشکشده انگور است که به صورت خام یا به عنوان یکی از اجزای تشکیلدهنده مواد غذایی در محصولاتی نظیر فراوردههای پخت استفاده میشود. ایران یکی از صادر کنندگان اصلی کشمش در سالهای اخیر محسوب میشود و کشمش ایران به کشورهای مختلفی صادر میگردد؛ ازاین رو اطمینان از کیفیت میکروبی و ایمنی این محصول از اهمیت زیادی برخوردار است
آفلاتوکسینها از نقطه نظر شیمیایی مشتقات فورانو کومارین1 محسوب می شوند که توسط روش پلیکتید2 تولید شده و شامل دو گروه دی-فوروکومارو سیکلوپنتانن - M1 ,B2 ,B1 - 3 و دیفوروکومارو لاکتون - G1 ,G2 - 4 میباشند که در گروه یک ترکیبات سرطانزا طبقه بندی شده اند. این ترکیبات هتروسیکلیک5 وزن مولکولی پایینی داشته و براساس منشأ اولیه، و نور فلورسانسی که در حضور اشعه فرابنفش دارند به چهار گروه اصلی B1، B2، G1 و G2 تقسیم میشوند. آفلاتوکسینهای B1 و B2 در طول موج 425 نانومتر و G1 و G2 در طول موج 450 نانومتر اشعه فرابنفش به ترتیب رنگ آبی و سبز زرد فلورسانس تولید میکنند
آفلاتوکسین از سموم خطرناک قارچی هستند که توسط گروهی از کپکها نظیر گونههای جنس آسپرژیلوس تولید میشوند و قادرند سبب آلودگی مواد غذایی از جمله کشمش گردند. در انگور و فراوردههای آن آسپرژیلوس فلاووس6 عامل اصلی تولید آفلاتوکسین میباشد. به طور کلی این سموم دارای اثرات سمی بر سیستم عصبی، سیستم ایمنی، ایجاد جهش ژنتیکی، نقص در جنین و سرطانزایی میباشند
در این پژوهش، ایزولههای قارچی جدا شده از نمونههای کشمش خراسان رضوی - پلویی، پیکامی و تیفی - ، با استفاده از روش مولکولی PCR Multiplex به منظور شناسایی قارچهای مولّد آفلاتوکسین مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین 45 نمونه کشمش، به لحاظ حضور DNA قارچهای تولید کننده آفلاتوکسین بررسی گردید.
مواد و روش ها:
-1 نمونه برداری
نمونه برداری از سه نوع کشمش پلویی، پیکامی و تیفی از شهرهای عمده تولید کننده کشمش در استان خراسان رضوی - شهرهای قوچان، کاشمر، بردسکن، خلیل آباد و مشهد - انجام گردید. کشمشها به سه روش آفتابی، تیزابی و گوگردی خشک شده بودند. از هر نوع کشمش پنج نمونه انتخاب شد. نمونههای خریداری شده پس از بستهبندی در شرایط استریل تا زمان انجام آزمایش در یخچال نگهداری شدند.
-2 جداسازی و خالصسازی قارچها
جداسازی ایزولههای قارچی با استفاده از محیط کشت PDA انجام شد. به منظور خالصسازی ایزولههای قارچی از روش سینگل اسپور7 استفاده گردید. بدین صورت که توسط آنس سوزنی ظریف میزان کمی از اسپور قارچی به لوله محتوی آب مقطر استریل منتقل شد و سپس توسط لام توما رقت آن محاسبه گردید. پس از تهیه رقتی مناسب، قطره ای از سوسپانسیون حاصل به محیط کشت واتر آگار انتقال یافت. پس از گذشت 12 الی 24 ساعت، از کلنی رشد یافته بر روی محیط واترآگار، به محیط کشت PDA که قبلا در پلیت استریل ریخته و سرد شده بوده در 3 نقطه انتقال داده شد و به مدت 5 تا 7 روز در دمای 25 œC گرمخانهگذاری گردید
-3 استخراج DNA قارچ از کپکهای ایزوله شده
برای استخراج DNA از کپکهای ایزوله شده، به کمک بیستوری استریل قطعهای از ایزوله خالصشده از محیط کشت PDA جدا گردید و به ارلن حاوی محیط کشت PDB انتقال یافت. ارلنها به انکوباتور شیکردار منتقل شده و به مدت 7 روز در دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفت. در این مدت عمل همزدن با سرعت 100 دور در دقیقه انجام شد تا از تولید اسپور توسط جدایهها جلوگیری شده و تنها میسلیوم آنها تکثیر گردد. در پایان هفتمین روز، میسلیوم کپکها با کمک کاغذ صافی واتمن در شرایط کاملاً استریل جدا شده و به پلیت استریل انتقال یافت. پس از نگهداری آنها به مدت یکشبانهروز در دمای -18 درجه سانتیگراد، توسط دستگاه فریز درایر خشک گردید.
در مرحله بعد، با کمک نیتروژن مایع نمونه خشک شده خرد و پودر یکنواختی از آن تهیه شد. سپس به میسلیوم قارچی پودر شده در ازت مایع، بافر لیز کننده Tris100Mm - ، EDTA0/05 M ، 1% W/V SDS، NaCl 0/9 M و - Na2So30/1 M و پروتئیناز k افزوده شد. به منظور ایجاد شوک حرارتی نمونه به مدت یک ساعت در دمای 65 درجه سانتی-گراد قرار گرفت. در این مدت هر 10 دقیقه یکبار نمونهها ورتکس شد تا لیز شدن دیواره سلولی به خوبی انجام شود.
سوسپانسیون حاصل به مدت 5 دقیقه با دور 2000 g سانتریفوژ شد. سوپرناتانت حاصل به میکروتیوب جدید منتقل گردید و با کلروفرم/ایزوآمیلالکل - به نسبت 24 به - 1 استخراج گردید. پس ازآن محلول به مدت 30 دقیقه در یخ قرار گرفت و به دنبال آن به مدت 15 دقیقه با 2000 g سانتریفوژ شد. سوپرناتانت حاصل به میکروتیوب جدید منتقل و DNA با حجم مساوی از ایزوپروپانول رسوب داده شد. به منظور رسوب بهتر و ظهور کلاف DNA، به مدت 24 ساعت در دمای -18 درجه سانتیگراد نگهداری شد. رسوب حاصل به مدت 5 دقیقه با 2000 g سانتریفوژ گردید. پس از آن شستشو با الکل 70 درصد برای خشک کردن DNA انجام شد. سپس سوپرناتانت حذف شده و رسوب باقیمانده در 100میکرولیتر آب مقطر دیونیزه مجدداً سوسپانس شد و تا انجام آزمایشات در -18 درجه سانتیگراد نگهداری گردید . - 13 - کیفیت استخراجی توسط ژل الکترفورز 1 درصد و دستگاه نانو دراپ مورد ارزیابی قرار گرفت.
-4 استخراج DNA کپک از نمونههای کشمش
با توجه به آنکه جداسازی DNA از نمونههای کشمش با روش فوق به سادگی مسیر نبود، به منظور استخراج DNA کپک از نمونههای کشمش از روشی که هانانیا8 و همکاران در 2004 معرفی نمودند، استفاده شد. ابتدا 100 گرم نمونهکشمش خرد شده به ارلن حاوی محیط کشت PDB انتقال یافت. ارلنها به مدت 8 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سپس نمونهها با کمک کاغذ صافی استریل صاف شده و به هاون چینی انتقال یافت و با کمک ازت مایع به صورت پودر یکنواختی درآمد.
به منظور استخراج DNA ابتدا از بافر هموژنیزه 0/5 M - هگزیلن گلیکول، 10 Mm تریس با pH=7/5 ، 10 Mm کلرید منیزیم، 0/5 % - v/v - تریتون x-100، 5 Mm بتا مرکاپتواتانول - استفاده شد. پس از مخلوط شدن کامل نمونه با بافر هموژنیزه، سانتریفوژ با 4000 g به مدت 10 دقیقه انجام شد. سپس پلت تشکیل شده با بافر شستشو 1 M - هگزیلن گلیکول، 10 Mm تریس با pH=7/5 ، 10 Mm کلرید منیزیم، 0/5 % - v/v - تریتون x-100، 5 Mm بتا مرکاپتواتانول - مخلوط مجدداً سانتریفوژ شد.
در مرحله بعد به پلت ایجاد شده بافر استخراج 0/35 M - سوربیتول، 0/1 M تریس با pH=7/5 ، EDTA 5 Mm ، % 0/4 بیسولفیت سدیم - بافر لیزکننده 0/2 M - تریس با pH=7/5 ، CTAB 2%، EDTA 5 Mm، 4 M کلرید سدیم، % - PVP 1 و سارکوزیل 5 درصد اضافه گردید. پس از انکوباسیون در دمای 60 درجهسانتیگراد به مدت 30 دقیقه، به منظور رسوب DNA، ابتدا از محلول کلروفرم/ایزوآمیلالکل - به نسبت 24 به - 1 استفاده شد و سپس به سوپرناتانت حاصل ایزوپروپانول افزوده شده و چند بار به آهستگی تکانداده شد.
میکروتیوبها به مدت 30 دقیقه در دمای -20 درجه سانتیگراد قرار داده و سپس سانتریفوژ شدند. پس از خارج نمودن سوپرناتانت، DNA ترسیب شده با الکل 80 درصد شستشو شد و در نهایت پس از خشک نمودن آن، با آب مقطر استریل رقیق گردید. در انتها به منظور جلوگیری از آلودگی DNA با RNA از RNase استفاده شد . - 9 - همچنین جهت اطمینان یافتن از استخراج DNA از نمونههای کشمش، نتیجه حاصل از عملیات استخراج DNA، بر روی ژل آگارز 0/8 درصد الکتروفورز گردید.
-5 انجام واکنش PCR به منظور شناسایی قارچهای مولّد آفلاتوکسین بررسی محصول PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز
شناسایی قارچهای مولّد آفلاتوکسین با استفاده از 4 جفت آغازگر مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین و بر اساس روش Multiplex PCR انجام شد. توالیهای آغازگرهای رفت و برگشت هر جفت در جدول 1 لیست گردیده است 6 - و. - 7 پس از اتمام واکنشها، برای اطمینان از تکثیر بهینه قطعات مورد نظور و جهت رویت قطعات، مقدار 5 میکرولیتر از هر محصول PCR بر روی ژل یک درصد آگارز، تحت ولتاژ 80 به مدت یک ساعت الکتروفورز شد. کلیه مواد لازم جهت انجام واکنش PCR و مراحل آن در جداول 2-3 تا 5-3 آمده است.
جدول :1 توالی نوکلئوتیدی جفت آغازگرهای مورد استفاده در شناسایی قارچهای مولّد آفلاتوکسین
جدول :2 ترکیبات لازم جهت انجام واکنش PCR جهت شناسایی قارچهای مولّد آفلاتوکسین
