بخشی از مقاله
چکیده :
با توجه به رشد روز افزون مصرف انواع فرآورده های گوشتی، شناسایی گونه های حیوانی استفاده شده در تهیه این فرآورده ها، به لحاظ مذهبی، اقتصادی و بهداشتی بسیارحائز اهمیت بوده و در این راستا مورد توجه سیاستگزاران قرار دارد.در ایران با توجه به مسائل اجتماعی و مذهبی ،جایگزینی غیر قانونی محصولات غذایی با گوشتهای ارزان تر ازجمله گوشت خوک دارای اهمیت ویژه ای بوده و در الویت قرار می گیرد.از این رو مطالعه حاضر به منظور طراحی پرایمر مناسب وکاملا اختصاصی برای توسعه یک تست تشخیصی مفید - - Real -time PCR جهت افتراق گونه گوشت و ارزیابی سطح جعل در فرآورده های گوشتی ،مورد توجه قرار گرفت.
توالی ژنوم میتوکندریایی گونه مورد نظر از سایت بانک جهانی ژن - - Gene Bank پیدا شد، پرایمر ها با استفاده از نرم افزار Gene Runner طراحی شد. سپس با NCBI BLAST اختصاصیتش برای چسبیدن به یک نقطه در ژنوم تایید شد. نتایج جستجو نشان داد که پرایمرها، محل اتصال منحصر به فردی را دارا میباشد. طراحی پرایمر برای بررسی وشناسایی افتراقی و اختصاصی گونه گوشت بر اساس تکنیک کمی Real-time PCR به روش سایبرگرین، با اختصاصیت بالاو بطور وسیعی می تواند مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه:
از زمان های قدیم گوشت دام های اهلی بعنو ان منبع پروتئین، انرژی، مواد معدنی و ویتامینی مورد توجه بشر و جزء لاینفک سفره غذایی بوده است . این مواد پروتئینی با توجه به شباهت زیاد ساختمانی و بیولوژیک با بدن انسان قابلیت استفاده بهتری نسبت به منابع پروتئینی گیاهی دارند. با وقوع تحولات صنعتی و پیشرفت تکنولوژی،روش های فرآوری گوشت و تولید محصولات پروتئینی نیز دچار تغییرات شگرفی شده و کارخانجات نوین تولید کننده مواد غذایی قادرند روزانه میلیون ها تن گوشت را فرآوری و به چرخه مصرف وارد کنند .
با توجه به رشد روز افزون مصرف انواع فرآورده های گوشتی، شناسایی گونه های حیوانی استفاده شده در تهیه این فرآورده ها، به لحاظ مذهبی، اقتصادی و بهداشتی بسیارحائز اهمیت بوده و در این راستا مورد توجه سیاست گزاران قرار دارد.در ایران با توجه به مسائل اجتماعی و مذهبی ،جایگزینی غیر قانونی محصولات غذایی با گوشت های ارزان تر ازجمله گوشت خوک دارای اهمیت ویژه ای بوده و در الویت قرار می گیرد.
مصرف کنندگان جهت حصول اطمینان ازکیفیت وسلامت محصولات غذایی نیاز به اطلاعات شفاف و دقیق جهت خرید مواد خوراکی دارند. همچنین تشخیص گونه از جمله مسائل مطرح در مدیریت حیات وحش و شناسایی شکارهای غیر مجاز در جهت مراقبت از گونه های حفاظت شده است و دارای جایگاه مهمی در امور قضایی نیز می باشد.
با توجه به اختلاف قیمت بین انواع گوشت مانند مرغ ، گاو و گوساله و نگرانی درمورد استفاده از گوشت تک سمی و خوک در تو لید این محصولات انجام این نوع مطالعات می تواند بسیار راهگشا باشد.
تشخیص گونه ها در محصولات غذایی با استفاده از ژن های مخصوص و بکارگیری روش واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR - در سالهای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است
تحقیقات فراوانی در زمینه تشخیص پروتئینهای حیوانی بعد از پیدایش جنون گاوی در غذای حیوانات و انسان صورت گرفته است و در این راستا روشهای فراوانی مورد ارزیابی قرار گرفته اند که هرکدام مزایا و معایبی را دارا می باشد .
از جمله روشهای رایج، روشهای میکروسکوپی است که احتیاج به کارشناسان خبره و تعلیم دیده دارد،همچنین روشهای ایمونولوژیکی مانند - 2 - ELISA روش حساسی در تشخیص گونه در گوشت خام می باشد از دیگر روشها، روشهای مولکولی می باشد که بر پایه PCR بر روی توالی های DNA هدف صورت می گیرد. روشهای مولکولی به علت حساسیت بالا بر روشهای ایمونولوژیک ارجحیت دارندحساسیت این روشها در اندازه ای است که تشخیص گونه در مواردی که گوشت حرارت بالا دریافت کرده است نیز امکان پذیر است
تکنولوژی مبتنی بر استفاده از DNA برای این منظور چندین مزیت دارد؛DNA در برابر حرارت نسبت به بسیاری از پروتئینها پایدارتر است و در نتیجه اسیدهای نوکلئیک در پروسه پردازش مواد غذایی کمتر دچار تخریب می شوند،در اکثر سلولهای ارگانیسم ها بدون در نظر گرفتن منشا و بافت وجود دارد و بنابراین اطلاعات یکسانی از هر نوع نمونه به دست می آید.دو روش عمده با استفاده از - 1 DNAتکنیک هیبریداسیون DNA و PCR - 2 می باشد که در روش اول پروب DNA لیبل شده با نمونه DNA ژنومی با پیوند کووالان متصل شده و هیبرید می گردد - - 6-4،با اینحال این روش برای تشخیص گوشت گونه های مشابه مثل گوسفند وبز به دلیل واکنش متقاطع روش سودمندی به حساب نمی آید. PCR یک روش و رویکرد امیدبخش آسان ،سریع و حساستر دیگری است که مورد استفاده قرار می گیرد
تشخیص و تمایز گوشت غیر حلال به عنوان یک الویت مطرح است و از اینرو نیاز به توسعه یک آزمون بسیار حساس احساس می شود،اگرچه روشهای مبتنی بر PCR بسیار حساس هستند اما نیاز به مراحل post- PCR برای جداسازی محصول توسط ژل الکتروفورز دارد که خود مستلزم صرف وقت می باشد و در عین حال این روش یک روش نیمه کمی است.با ظهور q-RT PCR توانستند بر این محدودیت غلبه کنند،در Real time PCR محصول PCR با استفاده از پروبهای فلورسنت و یا رنگ متصل شونده به DNA مثل سایبرگرین تشخیص داده می شود.این روش روشی خودکار،حساس ،سریع و کمی می باشدکه در آن حذف روشهای post- PCR ،آلودگیهای به وجود آمده ناشی از حمل محصول PCRرا نیز می کاهد
طراحی یک پرایمر مناسب برای توسعه یک تست تشخیصی مفید به منظور افتراق گونه های گوشت در فرآورده های گوشتی با هدف شناسایی و ارزیابی سطح جعل واختلاط گوشت خوک در محصولات غذایی با استفاده از روش q-RT PCR دارای اهمیت ویژه ای بوده و می تواند به عنوان قدم نخست در این راستا مطرح باشد.
مواد و روش ها:
DNA الگو و پرایمرها باید با جزئیات بیشتری مورد نظر قرار بگیرند.کارآمدی وحساسیت PCR بطور قابل ملاحظه ای به کارآیی پرایمر ها وابسته است . توانایی استفاده از یک الیگونوکلئوتید بعنوان پرایمر به چندین عامل بستگی دارد که عبارتند از - 1: حرآت شناسی اتصال و جداشدن primer-template در درجه حرارت annealing و extension ، - 2 اتصال ناجور از نظر پایداری و مکان اتصال نوآلئوتیدها ، و - 3 میزان کارآیی پلیمراز در تشخیص و تصحیح اتصالات ناجور در دو رشته DNA .پرایمر هایی که برای توالی هدف خاصی طراحی شده اند باید دارای معیارهایی صحیح مانند. : طول پرایمر ، ،%GC ، دمای annealing و melting ، پایداری انتهای'5 ، اختصاصی بودن انتهای' 3 و .... باشد. شاید مهمترین پارامتر موفقیت PCR طراحی پرایمر باشد بطوریکه طراحی بد پرایمر می تواند منجر به تولیدکم و یا عدم تولید محصول مطلوب، تولید محصولات غیر اختصاصی و یا تشکیل شود primer-dimer که با تولید محصول اصلی رقابت کرده و تولید آنرا سرکوب می نماید.
ابتدا توالی ژنوم میتوکندریایی گونه مورد نظر با مشخصه ی آن از سایت بانک جهانی ژن - - Gene Bank پیدا شد، پرایمر ها با استفاده از نرم افزار Gene Runner طراحی شدو با استفاده از نرم افزارPrimer Express Version 3، اختصاصیت دمایی آن برای دستگاهReal-time PCR ABI 7500 تائید شد . سپس با NCBI BLAST اختصاصیتش برای چسبیدن به یک نقطه در ژنوم آن هم ژن مورد بررسی تایید شد تا از منحصر به فرد بودن محل جفت شدن پرایمرها اطمینان حاصل شود.
جدول -1 توالی پرایمر طراحی شده برای تشخیص گوشت خوک
نتایج و بحث: نتایج جستجو نشان داد که پرایمرها، محل اتصال منحصر به فردی را دارا میباشد.
نتیجه گیری کلی:
نتایج حاصله نشان دهنده ضرورت گنجاندن آزمون های مبتنی بر PCR در استاندارد ملی ایران برای افزایش کیفیت است. برای این منظور روش Real-time PCR می تواند جهت کنترل سایر مواد غذایی نیز به لحاظ بررسی تقلب مورد استفاده قرار گیرد.
طراحی پرایمر برای بررسی وشناسایی افتراقی و اختصاصی گونه گوشت بر اساس تکنیک کمی Real-time PCR به روش سایبرگرین، با اختصاصیت بالاو بطور وسیعی می تواند به عنوان گام نخست در این زمینه مورد توجه قرار گیرد، .با توجه به این که در حال حاضر آن مواد پروتئینی که از منابعی غیر از گوشت گاو و گوسفند تولید می گردند بیشتر بصورت سنتی تهیه و عرضه می شوند و از ارزشنسبتاً پایینی برای تشخیص تقلب برخوردار هستند چندان مورد توجه سازمان استاندارد و بازرسین رسیدگی به صنایع غذایی نمی باشند
اجرای چنین آزمایشاتی شاید در حال حاضر در کشور با استقبال کمتری مواجه شوند، ولی با پیشرفت تکنولوژی و گذشت زمان که کل صنایع اختصاصی تر می گردد انتظار بر این است که فرآورده های پروتئینی هر گونه بصورت مجزا و اختصاصی تولید شود که قاعدتا دارای ارزش اقتصادی متفاوتی خواهند بود، لذا آزمایشات و تحقیقات مرتبط با این زمینه به خوبی خواهند توانست نیازهای سازمانهای مسئول را در زمینه بازرسی و ارزیابی محصولات گوشتی با روشی سریع ،حساس و قابل اعتماد مرتفع سازند
