بخشی از مقاله
چکیده
مایکوباکتریوم اوویوم زیر گونه پاراتوبرکلوزیس، عامل بیماري یون با انتشار گسترده جهانی می باشد.این بیماري موجب خسارات اقتصادي فراوان در گله هاي گاو شیري می شود. روشهاي مختلفی براي تشخیص مولکولی این بیماري وجود دارد که در میان آنها تست PCR به دلیل سریع وآسان بودن و حساسیت و ویژگی بالقوه بالاي آن مورد توجه بیشتري قرار گرفته است.
دفع بسیار ناچیز باکتري و حضور ممانعت کننده هاي PCR در مدفوع موجب شده است که شناسایی مولکولی باکتري به روش معمول PCR با مشکل همراه باشد. لذا به منظور افزایش دامنه حساسیت تست، نوعی Nested PCR طراحی شد که از توان تشخیصی بیشتري برخوردار می باشد. پرایمر ها وتست طراحی شده در نمونه هاي آزمایش شده توانستند مولکول هدف را به درستی شناسایی نمایند. به منظور اعتبار سنجی این تست لازم است نتایج آن با نتایج تستهاي استاندارد مورد مقایسه قرار گیرد.
تست معرفی شده شاید بتواند به عنوان یک تست بالقوه سریع و آسان در شناسایی موارد بالینی و تحت بالینی در برنامه هاي مبارزاتی بر علیه بیماري یون بکار گرفته شود.
مقدمه
مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس 1 - MAP - عامل بیماري یون، از انتشار وسیع جهانی برخوردار بوده و موجب عفونت گرانولوماتوز مزمن روده اي در نشخوارکنندگان اهلی و غیر اهلی می شود. بیماري داراي دو فرم تحت بالینی و بالینی می باشد که به دنبال آلودگی در سنین پائین اتفاق می افتد. بیماري در ابتدا به صورت تحت بالینی رخ می نماید و ظهور فرم بالینی به 2 تا 10 سال زمان از آغاز عفونت نیاز دارد - . - 1 تستهاي تجاري که در دو دهه اخیر براي تشخیص این بیماري طراحی شده اند بر اساس دو روش کلی شناسایی آنتی بادي اختصاصی در سرم یا شیر، و یا جستجوي باکتري - کشت یا شناسایی ژنوم - در مدفوع استوار می باشند. انواع متعددي از روشهاي 2PCR به عنوان یک تست سریع و آسان با ویژگی و حساسیت بالا براي تشخیص MAP مطرح شده اند
حضور تعداد کم باکتري در مدفوع در مراحل اولیه عفونت و فاز تحت بالینی بیماري و وجود ممانعت کننده هاي واکنش PCR در مدفوع، از کارآیی روشهاي معمولی PCR به منظور تشخیص بیماري می کاهد. لذا در این تحقیق روشی نوین از Nested PCR طراحی شده که دامنه حساسیت - Limit of Detection - تست را بالا برده و محدودیت هاي ناشی از تعداد کم مولکول الگو و بازدارنده هاي مدفوع را مرتفع می نماید - . - 4 بدین منظور از المنت IS900 در ژنوم باکتري MAP استفاده شد.
مواد و روشها
نمونه گیري: با استفاده از دستکش یک بار مصرف مامایی و با رعایت تمام شرایط ممانعت از آلودگی متقاطع - Cross-Contamination - ، نمونه هاي مدفوع بصورت مستقیم از رکتوم گاو گرفته شد. نمونه ها در ظروف مخصوص در کوتاهترین زمان به فریزر -20 درجه سانتی گراد منتقل گردیدند. استخراج DNA با استفاده از یک ملح کائوتروپیک و ستون فیبر شیشه اي - AccuPrep Stool DNA Extraction Kit, Bioneer - به انجام رسید. براي انجام مرحله اول واکنشPCR از پرایمرهاي - 5 - IS900، و به منظور تائید واکنش از پرایمرهاي Bovine mtDNA استفاده شد. توالی مربوط به ناحیه اي از ژن IS900 که به عنوان مولکول هدف در PCR اول انتخاب شده بود، با بخش هاي مشابه از گونه هاي مختلف مایکوباکتریوم Multiple Alignment شده و از نواحی محافظت شده - Conserved - با استفاده از نرم افزار Primer-Premier، پرایمر هاي Nested طراحی و سنتز - Bioneer, S. Korea - گردید.
واکنش :PCR واکنش PCR در حجم 25 مایکرولیتر با غلظت هاي نهایی انواع دزوکسی نوکلئوتید تري فسفات - - 0.2mM ، کلرور منیزیوم - 2mM - ، 10 پیکومول - pmol - از هر یک از آغازگر رفت
وبرگشت، آنزیم - 1 U - Taq DNA Polymerase، با 35 سیکل 94 درجه به مدت 30 ثانیه، 62 درجه به مدت 45 ثانیه، و 72 درجه به مدت 90 ثانیه انجام شد. براي انجام Nested-PCR محصول PCR بدست آمده به نسبت 1 به 10 رقیق گردیده و دو مایکرولیتر از آن به عنوان DNA الگو به کار گرفته شد. به استثناي دماي اتصال 59 درجه، مابقی شرایط از جمله غلظت معرف ها و سیکل هاي حرارتی مشابه PCR اولیه بود. نهایتاً 5μl از امپلیکون در ژل آگاروز %3 الکتروفورز شده و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید با غلظت 0/5 میکرو گرم درمیلی لیتر به روش post- staining، نتایج تحت اشعه UV ملاحظه و توسط دستگاه مستند سازي ژل - Gel Documentation Apparatus - ثبت گردید.
نتایج و بحث
با مشاهده باند مربوط به DNA ژنومیک در نمونه هاي الکتروفورز شده بر روي ژل آگاروز، صحت
فرآیند استخراج DNA از نمونه هاي مدفوع تایید گردید. آنالیز نتایج کنترل داخلی - Bovine mtDNA - براي تمام نمونه ها، صحت انجام فرآیند کار را از مرحله استخراج تا تکثیر و نیز عدم تداخل مواد بازدارنده موجود در مدفوع را اثبات نمود. نتایج PCR اولیه با مشاهده باند بسیار ضعیف به اندازه 628 جفت باز یا فقدان محصول مورد انتظار همراه بود. این تکثیر بسیار ضعیف با افزودن تعداد سیکل هاي متوالی تا حد 50 سیکل کماکان مطرح بود.
این نتیجه می تواند به دلیل حضور بازدارنده هاي موجود در مدفوع، یا عدم کارایی - Efficiency - ایده آل واکنش تکثیر یا کمیت اندك ِDNA الگو باشد. البته تکثیر ضعیف محصول Bovine mtDNA ظن حضور باز دارنده هاي مدفوع را قوي تر می نماید. اگر چه براي رقیق کردن ممانعت کننده ها، اسید نوکلئیک استخراجی با میزان بیشتري تریس مخلوط شده بود. بر اساس نتایج حاصل از PCR مرحله اول ضرورت یافت که به منظور افزایش حساسیت تست، یک جفت پرایمر Nested بر اساس توالی نواحی حفاظت شده طراحی و آزمایش شود.
نتایج Nested-PCR نشانگر تکثیر مولکول هدف با اندازه مورد انتظار 107 جفت باز - شکل - 1 در تمامی نمونه هاي مورد آزمایش بود. قوي بودن - intensity - باند مربوط به آمپلیکون هدف، را شاید بتوان به عنوان نمودي از کارایی پرایمر ها و واکنش PCR طراحی شده قلمداد نمود. البته اثبات کارآیی تست nested معرفی شده نیازمند اقدامات تکمیلی بیشتري می باشد. ارزیابی کارایی تست در اولین قدم، نیازمند بررسی محدوده ردیابی و قدرت جستجوي - Limit of Detection - پرایمرها و توانایی شناسایی اختصاصی MAP در حضور سایر گونه هاي مایکوباکتریوم اویوم ودیگر ارگانیسم هاي وابسته و غیر وابسته - ویژگی پرایمرها - می باشد.
لازم است تست طراحی شده در این تحقیق با روش هاي دیگر استاندارد 5 - و - 6 مقایسه و اعتبار سنجی - validate - شود تا بتواند به عنوان یک روش معتبر با حساسیت و ویژگی بالا جهت غربالگري و تشخیص مولکولی فرم هاي بالینی و تحت بالینی بیماري یون بکار گرفته شود.. بکار گیري این تست به عنوان یک تست بالقوه آسان و سریع در غربالگري مدفوع گاو هاي بدون علائم و شناسایی فرم بالینی بیماري می تواند محک خوبی براي ارزیابی این تست باشد.
شکل.1 نمونه اي از نتایج Nested –PCR
