بخشی از مقاله
استفاده از بیومارکرها همواره به عنوان ابزاری در
غربالگری و پایش زود هنگام بیماریها و به ویژه
مواجهههای شغلی و محیطی مورد توجه بوده است. در
این میان همواره توجه محققان بر روی به کارگیری بیومارکرهایی بوده تا علاوه بر آن که به خوبی بتوانند
گویای وضعیت فیزیولوژیک فرد باشند، غیرتهاجمی بوده
و مورد مقبولیت بیمار نیز باشد. یکی از روشهایی که طی سالهای اخیر برای بررسی بیومارکرهای مواجهه و
بیماری در سمشناسی شغلی و پزشکی بسیار مورد توجه قرار گرفته است، آنالیز هوای بازدمی میباشد(.(1 به طور
کلی هوای بازدمی انسان مشتمل بر بیش از 200 نوع
ترکیب مختلف میباشد که بسته به وضعیت سلامتی و همچنین شرایط لحظهای فرد از قبیل گرسنگی، انجام
فعالیت ورزشی و ... تغییراتی در کیفیت و کمیت آنها ایجاد می شود. وجود تعدادی از ترکیبات در هوای بازدمی انسان میتواند بیانگر شرایط درونی و فیزیولوژیکی فرد بوده و اطلاعات ارزشمندی را در مورد سلامت فرد ارائه دهد(.(2 استفاده از هوای بازدمی تاکنون به عنوان ابزاری در تشخیص پارهای از بیماریها از قبیل دیابت، عفونتهای دستگاه گوارشی و مشکلات کلیوی مورد استفاده قرار گرفته است. امروزه با ابداع روش های بسیار حساس و دقیق استخراج و جداسازی ترکیبات و همچنین وجود دستگاههای پیشرفته آزمایشگاهی، این تکنیک برای
مطالعه بیومارکرها اهمیت زیادی یافته است(.(3 یک
دسته از بیومارکرهای بسیار مهم در حیطه سمشناسی و
طب کار، بیومارکر های استرس اکسیداتیو می باشند.
عوامل زیانآور و مواجهات متعددی در محیطهای شغلی
وجود دارند که قادرند با ایجاد استرس اکسیداتیو عوارضی را در بدن ایجاد نمایند. استرس اکسیداتیو در
نتیجه عدم تعادل بین تولید رادیکال آزاد و گونههای فعال اکسیژن از یک سو و سیستم دفاع آنتیاکسیدانی از سوی دیگر ایجاد میگردد. به عبارت دیگر در سیستمهای
بیولوژیک هوازی به منظور مقابله با رادیکالهای آزاد و
فصلنامه علمی تخصصی طب کار/ دوره ششم/ شماره دوم/ تابستان 14 /93
گونههای فعال اکسیژن، مکانیسمهای دفاع آنتی اکسیدانی
طراحی شده است تا اثرات زیان بار این عوامل مهاجم را
خنثی کرده و یا به حداقل برساند(.(3 مطالعات نشان داده
است که پس از مواجهه با پاره ای از آلایندههای هوا، مارکرهای استرس اکسیداتیو در ماتریسهایی مانند خون
و بازدم افزایش پیدا می کند(5،.(4 هرچند اغلب این
مطالعات در مورد تاثیر آلودگی هوا بر جمعیتهای غیرشغلی بوده است. وجود مارکرهای مختلف استرس
اکسیداتیو از قبیل محصولات پر اکسیداسیون لیپیدی در هوای بازدمی در سالهای اخیر مورد بررسی قرار گرفته
است. برای اندازهگیری میزان پر اکسیداسیون لپیدها
روشهای متعددی طراحی شده است. در بعضی از این روشها با اندازهگیری محصولات حاصل از پر
اکسیداسیون لپیدها وضعیت پر اکسیداسیون لپیدی سنجیده میشود. یکی از مهمترین محصولات حاصل از پراکسیداسیون لپیدها، مالون دی آلدهید میباشد که بسیار مورد توجه بوده و به طور وسیعی مورد سنجش قرار میگیرد(.(6 مطالعات متعددی تاکنون به بررسی میزان مالون دی آلدهید در هوای بازدمی افراد با بیماریهای مختلف پرداختهاند 7-10)، .(4
یکی از مراحل اصلی در به کارگیری هوای بازدمی جهت تعیین بیومارکرها، نمونهبرداری و جمعآوری صحیح آن میباشد. تاکنون روشهای متعددی جهت
نمونهبرداری و تغلیظ این ماتریس صورت پذیرفته
است(.(11-13 در این مطالعه کارایی یک سیستم مبتنی
بر چگالش هوای بازدمی و نمونهبرداری از کندانس ایجاد
شده (Exhaled breath condensate) در تعیین مقدار
مالون دی آلدهید هوای بازدمی مورد بررسی قرار گرفت.
روش بررسی
طرح اولیه نمونهبردار پس از مطالعه سایر طرحهای موجود، بر اساس سیستم مبتنی بر چگالش با استفاده از آب انتخاب گردید(15،.(14 بر این اساس سیستم مذکور
/15 ساخت نمونه بردار کندانس هوای بازدمی جهت مطالعه بیومارکرهای ..
متشکل از کندانسور غیرتماسی، پمپ جریان آب، دریافت نمودیم، مبرد با طول 25 سانتی متر و دمای صفر
دماسنج، محل جمعآوری نمونه، و منبع تغذیه الکتریسته درجه به منظور جمعآوری کاندنس هوای بازدمی انتخاب
بود. به منظور دمیدن درون دستگاه از یک لوله قابل گردید. به منظور کنترل دما از دماسنج جیوهای استفاده
انعطاف متصل به لوله شیشهای و دهنی استفاده شد. گردید، به نحوی که هنگامی که دمای مخلوط آب و یخ
شکل 1 نمای باز شده این سیستم را نشان داده است. به صفر درجه میرسید پمپ را روشن نموده و
هوای بازدمی با عبور از بخش داخلی کندانسور شیشهای نمونهبرداری آغاز میشد.
که با جریان آب خنک گردیده است، به حالت فوق اشباع به منظور بررسی کارایی دستگاه ساخته شده از 5 فرد
رسیده و رطوبت خود را بر روی دیواره کندانسور از سالم و 5 فرد سیگاری به منظور مقایسه میزان مالون دی
دست میدهد. آلدهید هوای بازدمی استفاده شد. در ضمن این افراد از
قطرات ایجاد شده در سطح داخلی کندانسور به پایین لحاظ BMI، سابقه کاری و سن همانندسازی شده بود و
ظرف هدایت شده و در یک میکروتیوب نگهداری تنها تفاوت در مصرف سیگار این افراد بوده است
میگردند. با توجه به حجم نمونه مورد نیاز برای آنالیز درضمن تمامی افراد مورد مطالعه مرد بودهاند. مالون دی
مالون دی آلدهید طبق روش انتخابی در این پژوهش، به آلدهید بر اساس شرایط ذکر شده در قسمت مواد و
این دلیل که در این طول و دما بیشترین بازدهی را روشها، در دقیقه 1و 4 استخراج گردید(شکل.(2
شکل -1 نمایی از دستگاه نمونهبرداری هوای بازدمی
نمونهبرداری: نمونهبرداری از 10 نفر جهت بررسی مالون
دی آلدهید هوای بازدمی انجام گردید. ابتدا از افراد خواسته شد با کمک گیره ای بینی خود را بگیرند و سپس با یک فرکانس ثابت به مدت 4 دقیقه درون دهنی که
برای هر فرد به صورت جداگانه تعبیه شده بود بدمند.
هوای بازدمی پس از مواجهه با دمای صفر درجه به صورت مایع و کندانس شده در انتهای دستگاه درون میکروتیوب جمعآوری گردید. نمونهها پس از جمعآوری
علی فیروزی چاهک و همکاران فصلنامه علمی تخصصی طب کار/ دوره ششم/ شماره دوم/ تابستان 16 /93
در ظرف آب یخ نگهداری شد و بلافاصله پس از انتقال
به آزمایشگاه در یخچال با دمای -20 درجه نگهداری
شدند.
تجزیه و تعیین مقدار :MDA جهت آمادهسازی و تجزیه نمونهها، تیوباربیتیک اسید (TBA) از شرکت سیگما و
نمک مالون دی آلدهید تترا بوتیل آمونیوم TBA-) (MDA با درجه خلوص بالای %96 از شرکت سیگما و اتانول ساخت مرک آلمان خریداری گردید. آمادهسازی با استفاده از مشتق گیری و بر اساس شیوه ارائه شده
توسط Larstad و همکارانش صورت گرفت(.(10
تجزیه نمونهها با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا مجهز به دتکتور فلورسانس همراه با ستون
C18 صورت پذیرفت. به منظور تجزیه نمونهها 50 میکرولیتر از TBA-MDA به دستگاه HPLC تزریق گردید. فسفات بافر20 میلیمولار با pH، 6/8 به همراه استونیتریل با نسبت (80/20) به عنوان فاز متحرک مورد
استفاده قرار گرفت. دتکتور فلورسانس در طول موج
تهییج 532 و نشر 553 تنظیم گردید. مقدار gain در
دستگاه برابر با 100 در نظر گرفته شد. بررسی پیکها
توسط توسط نرمافزار Empower pro صورت گرفت. آنالیزهای آماری: نتایج بررسی مالون دی آلدهید در
هوای بازدمی دو گروه سیگاری و غیرسیگاری با استفاده
از آزمون T مستقل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
یافتهها
برای تعیین پارامترهای بهینه نمونهبرداری هوای بازدمی 3 نوع مبرد با اندازههای 15 ،25 و40 سانتیمتری انتخاب و در دو دمای 5 و صفر درجه سانتی گراد از
هوای بازدمی نمونهبرداری گردید (جدول .(1 زمان تشکیل
اولین قطره در مبرد با طول کوتاهتر، کمتر میباشد؛ اما
حجم نهایی جمعآوری کاندنس در مبرد با طول بزرگتر، بیشتر میباشد. در دمای صفر درجه حجم نهایی بازدمی جمعآوری شده نسبت به دمای 5 درجه بیشتر میباشد و همچنین زمان تشکیل اولین قطره نیز کوتاهتر میگردد.
جدول -1 کاندنس جمعآوری شده از هوای بازدمی در دمای صفر درجه سانتیگراد
طول مبرد (سانتیمتر) زمان تشکیل اولین قطره (ثانیه) حجم کاندنس جمعآوری شده پس از 5 دقیقه (میکرولیتر)
15 123 90
25 157 210
40 242 540
جدول -2 کاندنس جمعآوری شده از هوای بازدمی در دمای 5 درجه سانتیگراد
طول مبرد (سانتیمتر) زمان تشکیل اولین قطره (ثانیه) حجم کاندنس جمعآوری شده پس از 5 دقیقه (میکرو لیتر)
15 170 60
25 220 150
40 349 360
/17 ساخت نمونه بردار کندانس هوای بازدمی جهت مطالعه بیومارکرهای ..
نمودار -1 مقایسه کاندنس جمعآوری شده از هوای بازدمی در دمای صفر و 5 درجه سانتیگراد
همانطور که در جدول 1 مشاهده میگردد، میانگین همانطور که از آزمون بر آورد میشود بین افراد
سطح پیک مالون دی آلدهید در افراد سالم برابر با سیگاری و سالم از نظر مقدار مالون دی آلدهید تفاوت
702323/2 و در افراد سیگاری برابر با 1328153/6 معناداری وجود دارد (Pvalue<0/05) و این موضوع در
میباشد. نمودار 1 نیز به وضوح مشخص میباشد.
جدول-3 مقایسه و توزیع میزان مالون دی آلدهید در دو گروه سالم و سیگاری
نمونه میزان مالون دی آلدهید t df Pvalue
تعداد میانگین انحراف معیار
سیگاری 5 1328153/6 373339/83 2/64 8 0/029
سالم 5 702323/2 373636/66
نمودار -2 مقایسه و توزیع میزان مالون دی آلدهید در دو گروه سالم و سیگاری
