بخشی از مقاله
مختلف نيتروژن و کربن بر رشد آنها به کمک آناليز فلاکسهاي متابوليک
چکيده
باکتريهاي متانوتروف دسته اي از متيلوتروفها هستند که مي توانند از متان به عنوان تنها منبع انرژي و کربن استفاده کنند. متانوتروفها در سه نوع I،II و X طبقه بندي مي شوند. توليد پروتئين تک ياخته ، توليد متانول از متان ، مصرف متان اتمسفري و جلوگيري از اثرات گلخانه اي آن و تجزيه مواد شيميايي سمي از جمله کاربردهاي آنها مي باشد. در اين تحقيق پس از تهيه مدلهاي متابوليک متانوتروفهاي نوع I و II، توزيع فلاکسها هنگام حداکثر نمودن شدت رشد ويژه براي منابع مختلف نيتروژن (آمونيوم ، نيترات و نيتروژن ملکولي ) و کربن (متان و متانول ) توسط نرم افزار Lingo بدست آورده شده است . نتايج نشان مي دهد که در هر دو نوع هنگام استفاده از آمونيوم به جاي نيترات ، شدت رشد ويژه بيشتر مي گردد. شدت رشد ويژه در منبع آمونيوم با فرض شدت ويژه مصرف متان برابر ۱۰۰۰ ميکرومول بر هر گرم خشک سلول در ساعت براي متانوتروفهاي نوع I و II به ترتيب برابر
محاسبه شده است . تحقيقات نشان مي دهد که برخي از باکتريهاي متانوتروف علاوه بر متان قادر به استفاده از متانول به عنوان منبع کربن هستند و بازده رشد بالاتري به ازاي هر مول متانول نسبت به يک مول متان دارند و همچنين نياز به مصرف اکسيژن کمتري دارند. در صورتيکه شدت رشد ويژه متانوتروفهاي نوع I در حالت رشد در متانول باشد حداقل شدت مصرف ويژه متانول و متان به ترتيب برابر ۴۷۳۰ و ۶۹۷۱ ميکرومول بر هر گرم خشک سلول بر ساعت توسط مدل متابوليکي به دست مي آيد. بازده مصرف اکسيژن در متانوتروفهاي نوع I با استفاده از متان ، ۷.۶۵ برابر بيشتر از بازده مصرف اکسيژن در متانول است .
کلمات کليدي : متانوتروف ، حداکثر رشد ويژه ، فلاکسهاي متابوليکي ، منابع نيتروژن
مقدمه
باکتريهاي متيلوتروفيک باکتريهاي هوازيي هستند که از ترکيبات يک کربنه اي که درجه احيا آنها از اسيد فورميک بيشتر است بعنوان منبع انرژي و کربن استفاده مي نمايند. اين
ميکروارگانيسم ها ابتدا اين منابع کربني را به فرمالدهيد تبديل و سپس از آن براي تامين عمده کربن سلولي استفاده مي کنند [۱]. باکتريهاي متانوتروفيک يا متانوتروفها، زيرمجموعه اي از متيلوتروفها مي باشند که بر حسب تعريف هوازيهاي گرم منفي اي هستند که قادرند از متان به عنوان تنها منبع انرژي و کربن استفاده کنند [۸ و ۹]. متانوتروفها به سه نوع I ،II و X تقسيم مي گردند [۳]. متانوتروفهاي نوع I از مسير ريبولوزمونوفسفات (RuMP) براي جذب فرمالدهيد استفاده کرده ، داراي غشاء اينتراسيتوپلاسمي بوده و درصد مولي C+G در DNA آنها بين ۵۰ تا ۵۹ است . متانوتروفهاي نوع II از مسير سرين براي تثبيت فرمالدهيد استفاده نموده و درصد مولي C+G در DNA آنها بين ۶۲ تا ۶۷ درصد مي باشد. اين گروه در شاخه α از پروتئوباکتريها قرار دارند [۳ ، ۵ و۸]. جدول (۱) تفاوتهاي متانوتروفهاي نوع I و II را نشان مي دهد. يک گروه جديد يعني نوع X براي جا دادن باکتريهايي که ويژگيهاي نوع I و II را دارا هستند و همانند متانوتروفهاي نوع I از مسير ريبولوز مونوفسفات بعنوان مسير اوليه جذب فرمالدهيد استفاده مي کنند، اضافه شده است [۵ و ۸]. متانوتروفهاي نوع X از نوع I بدينصورت تشخيص داده مي شوند که مقادير کمي از آنزيمهاي مسير سرين ، ريبولوزبيس فسفات کربوکسيلاز يعني آنزيم حاضر در چرخه کالوين -بنسون دارند، همچنين در دماهاي بالاتري نسبت به انواع I و II رشد مي کنند و درصد مولهاي C+G در DNA آنها از اغلب متانوتروفهاي نوع I بيشتر است [۸].
متانوتروفها نقش مهمي در محيط زيست و زندگي بشر دارند. توليد پروتئين تک ياخته با توجه به کمبود مواد غذايي پروتئيني و افزايش جمعيت زمين يکي از مهمترين ابعـاد کـاربردي آنهـا مي باشد [۹]. پروتئين تک ياخته توده زيستي است که براي مصرف حيوانات استفاده شده [۳]
و با توجه به ارزاني و در دسترس بودن متان ، استفاده از اين منبـع بـراي توليـد پـروتئين تـک ياخته از نظر اقتصادي مقرون به صرفه است [۹]. از ديگر کاربردهاي متانوتروفهـا مـي تـوان بـه توليد متانول از متان اشاره کرد. متانول يک جايگزين مهم براي سوختهاي فـسيلي اسـت و بـه
عنوان حلال و نيز واسطه در بسياري از صنايع شيميايي مورد استفاده قرار مي گيرد [۳]. مصرف متان اتمسفري و جلوگيري از اثرات نامطلوب متان به عنوان يک گاز گلخانه اي در گـرم شـدن کره زمين از ديگر فوايد متانوتروفها مي باشد [۸]. همانطور که مي دانيم با پيشرفت تکنولـوژي و صنايع هر روز مقدار زيادي مواد آلاينده وارد محيط زيست مي شود و حذف اين آلاينده ها نقش مهمي در حفظ محيط زيست و سلامت انسانها و ديگر موجودات دارد. متانوتروفها قابليت زيادي در تجزيه بيولوژيکي مواد شيميايي از قبيـل هيـدروکربنهاي هالوژنـه مثـل تـري کلـرو اتـيلن
( TCE ) و هيدروکلروفلوئوروکربنها که از آلوده کننده هاي مهم در کشورهاي صـنعتي هـستند، دارند [۳، ۶، ۸، ۱۳ و ۱۶].
مواد و روشها
توزيع فلاکسها با استفاده از مدل استوکيومتري واکنشها و موازنه جرم براي متابوليتهاي داخـل سلولي محاسبه مي شوند. شدتهاي اندازه گيري شده مصرف سوبستراها و يا توليـد محـصولات و تعداد معدودي از پارامترهاي فيزيولوژيک سلولي ورودي هاي مدل را تشکيل مي دهند. خروجي نهايي يک نقشه فلاکس متابوليکي است که دياگرامي از فلاکسهاي واکنشها را نـشان مـي دهـد
[۱۴]. با مقايسه نقشه هاي متابوليکي مي توان اثر تحريکات ژنتيکي و محيطي را ارزيابي نمود و نيز اهميت مسيرهاي خاص و واکنـشهاي خـاص در مـسيرها را توصـيف نمـود.سـرآغاز آنـاليز فلاکسها موازنه جرمي متابوليتها مي باشد [۱۲ و ۱۵]. موازنه جرمي متابوليتهاي درون سلولي را ميتوان بصورت برداري نشان داد که در آن rmet بـردار شـدتهاي ويـژه متابوليتهـاي درون سـلولي و Xmet بـردار غلظتهـا بـوده و هـر دو داراي واحـد مي باشند و μ شدت ويژه رشد سلولي با واحد است [۱۴ و ۱۵]. با فرض حالت شـبه پايـا و غلظتهاي بسيار پايين متابوليتهاي داخل سلولي ، معادلـه فـوق بـصورت سـاده ميشود. G ماتريس ضرائب متابوليتهاي درون سلولي است . با حل اين معادله مي توان بـردار vرا که عناصر آن فلاکسهاي مجهول مسيرهاي متابوليکي هـستند بدسـت آورد [۱۲]. در اغلـب موارد تعداد معادلات از تعداد مجهولات کمتر است ، پس بينهايـت جـواب بـراي ايـن معـادلات وجود دارد که در اين حالت براي رسيدن به جواب يک تـابع هـدف مناسـب تعريـف شـده و از روش برنامه ريزي خطي براي بهينه کردن تابع هدف استفاده مي شود.
در مدلهاي متابوليـک شـبکه اي از واکنـشها شـامل اکـسيداسيون متـانول ، جـذب فرمالدهيـد، گليکوليزز، مسير پنتوزفسفات ، چرخه اسـيد سـيتريک، مـسيرهاي بيوسـنتز اسـيدهاي آمينـه ، واکنشهاي اسيد فوليک، فسفوريلاسيون هوازي ، واکنشهاي آناپلروتيک، مصرف نيترات ، سولفات و فسفات ، بيوسنتز نوکلئوتيدها و اسيد چرب ، بيوسنتز ماکروملکولهـاي تـشکيل دهنـده سـلول مثل پروتئين ، DNA،RNA ، فسفوليپيد، گليکوژن و فعاليت ترانس دهيدروژناز در نظـر گرفتـه شده اند. ضرايب استوکيومتري اجزاء سازنده پروتئين ، DNA،RNA و توده زيـستي ، مـشابه بـا E. coli قرار داده شده اند [۱۰]. گليکوژن منبع ذخيره انرژي و پالميتيت به عنوان اسيد چرب
تشکيل دهنده فسفوليپيد در نظر گرفته شده اند. با داشتن شبکه واکنشهاي بيوشـيميايي بـراي هر يک از متابوليتهاي سلولي ، موازنه جرم نوشته شده است در نتيجه به ازاي هر متابوليت يک معادله و به ازاي هر واکنش يک مجهول وجود دارد. با حل مدل و محاسـبه مجهـولات ، مقـدار فلاکس هر يک از واکنشها و شدت رشد ويژه به دست مي آيد. بـا توجـه بـه اينکـه در دسـتگاه معادلات به دست آمده تعداد مجهولات بيش از معادلات است ، سيستم بايد با تعريف يک تـابع هدف از طريق برنامه ريزي خطي حل شود که براي اين منظور از نرم افزار Lingo استفاده شده است . Lingo نرم افزاري است که مي تواند مدلهاي خطي و غيرخطي را حل نموده و به تحليـل آن بپــردازد. مــدل متابوليــک بــراي متانوتروفهــاي نــوع I کــه از مــسير ريبولوزمونوفــسفات ( RuMP ) استفاده مي کنند با منبع نيتروژن نيترات ، شامل ۱۸۲ معادلـه و ۲۳۲ مجهـول و بـا منبع نيتروژن آمونياک شامل ۱۷۹ معادله و ۲۲۹ مجهول و براي متانوتروفهـاي نـوع II کـه از مسير سرين و منبع نيتروژن نيترات استفاده مي کنند ۱۸۵ معادله و ۲۴۲ مجهول و بـا تثبيـت نيتروژن شامل ۱۸۲ معادله و ۲۳۹ مجهول مي باشد. با استفاده از اين مدلهاي متابوليک و آناليز فلاکسها، حداکثر رشد ويژه براي هر يـک از متانوتروفهـا محاسـبه و رشـد آنهـا تحـت شـرايط مختلف بررسي شده است . در تمام اين آناليزها مقدار مصرف ويژه متان برابر ۱۰۰۰ ميکرومـول بر گرم سلول خشک بر ساعت در نظر گرفته شده است .
به علت محدوديت فضائي در ترسيم نقشه فلاکسهاي متابوليـک، از واکنـشهاي ميـاني و يـا بـا اهميت کمتر صرفنظر شده و تنها واکنشها و مسيرهاي مهـم در نقـشه قـرار گرفتـه انـد. نقـشه متابوليک با استفاده از نرم افزار ٢٠٠٣ Microsoft Excel تهيه شده است . بـه علـت تفـاوت در مسير جذب فرمالدهيد در متانوتروفهاي نوع I و II، براي هر يک از آنها نقشه جداگانـه اي ارائـه شده است . واحدهاي به کار رفته براي مصرف و يا توليد هر يک از اجزاء، ميکرومول آن جزء بـر گرم خشک سلول در ساعت مي باشد. اعداد روي نقشه نشان دهنده فلاکـسهاي محاسـبه شـده واکنشها مي باشد که با نرم افزار Lingo به دست آمده اند. مقادير منفي بيانگر اين مطلب هستند که واکنش مربوطه در جهت عکس انجام مي گيرد.
نتايج و بحث
براي بررسي اثر منبع نيتروژن سه منبع : نيتروژن ملکولي ، نيترات و آمونياک در نظر گرفته شد و تأثير اين منابع در شدت رشد ويژه باکتري هاي نوع I و نوع II در شدت ويژه مصرف متان يکسان بررسي گرديد. نتايج بدست آمده از مدل متابوليکي در جدول (۲) مشاهده مي شود.
نتايج بدست آمده نشان مي دهد که در هر دو نوع I و II راندمان رشد هنگام استفاده از نيترات کمتر از راندمان رشد هنگام استفاده از آمونياک مي باشد و درصد اين کاهش به ترتيب برابر
۲۵.۴ و ۲۱.۰ مي باشد . استفاده از نيتروژن ملکولي در نوع II منجر به کاهش ۲۴.۱ درصدي راندمان رشد نسبت به حالت استفاده از آمونياک مي گردد. مقايسه درصدهاي کاهش راندمان رشد در نوع II هنگام استفاده از نيتروژن ملکولي و نيترات نسبت به آمونياک نشان مي دهد که نيتروژن ملکولي منجر به ۳.۱ درصد کاهش بيشتر در راندمان رشد مي گردد. علت اين امر نياز به مصرف مقداري ATP علاوه بر NADPH براي جذب هر ملکول نيتروژن و تبديل آن به آمونياک مي باشد. نقشه فلاکسهاي متابوليکي به همراه فلاکسهاي محاسبه شده براي دو نوع I
و II در حالت استفاده از نيترات در شکلهاي (۱) و (۲) آورده شده است .
براي مقايسه نتايج محاسبه شده با نتايج تجربي از داده هاي آزمايشگاهي کونگ هيوچو
( Kung-Hui Chu ) و آلوارز کوهن ( Alvarez-Cohen ) استفاده مي کنيم . اين محققين شدتهاي رشد ويژه را براي گونه هاي OBb٣ و ٢-CAC از متانوتروف نوع II
M. trichosporium در منابع مختلف نيتروژن بدست آورده اند که خلاصه آن در جدول (۳) مشاهده مي گردد [۴].
آنها در آزمايشات خود دريافتند که کشتهاي OBb3 و ٢-CAC الگوهاي رشد مشابهي نشان مي دهند. تثبيت نيتروژن ملکولي نرخهاي رشد پائينتري نسبت به منابع ديگر استفاده شده نشان مي دهد. نتايج حاصل از مدل و داده هاي تجربي روند تغييرات مشابهي را در شدت رشد ويژه و راندمان رشد براي هر يک از منابع نيتروژن نشان مي دهد. تفاوتهاي مشاهده شده بين شدت رشد ويژه محاسبه شده و تجربي به اين دليل مي باشد که نتايج محاسباتي با فرض مصرف ويژه ۱۰۰۰ ميکرومول متان بر گرم سلول خشک بر ساعت در تمام حالتها بدست آمده است ، در حاليکه در شرايط آزمايشگاهي اين اعداد نه تنها ممکن است در تمام حالتها يکسان نباشند بلکه مقدار آنها با عدد فرض شده قطعاً متفاوت مي باشد. از آنجا که شدتهاي مصرف
ويژه متان در داده هاي تجربي موجود نيست لذا نمي توان مقايسه کمي در مورد شدتهاي رشد ويژه انجام داد. راندمانهاي رشد در تمام داده هاي تجربي کمتر از نتايج محاسباتي مي باشند.
تفاوتهاي مشاهده شده به اين دليل است که مدل اولاً شدتهاي رشد ويژه "بهينه " را محاسبه نموده و دوما انرژي مورد نياز براي بقاي سلول در آن در نظر گرفته نشده
