بخشی از مقاله
مقدمه
در طی چند دهه گذشته با کشف 5 نـوع اصـلی ویـروسهـای هپاتیت A) تا (E و توسعه روشهای تشخیصی حساس برای هر کدام، پیشرفتهای قابل توجهی در مورد توصیف ویـروسهـای هپاتوتروپیک انسانی صورت گرفته است. به هر حال هنوز بخش نسبتاً کوچکی از موارد هپاتیتی حاد و مزمن باقی مانده است کـه قابل استناد به این ویروسها یا به ویروسهایی که گمان میرود برخی اوقات باعث آسیبهای کبدی بدون بروز علایم مشخـصه خاص شوند (انتروویروسهای معین، آدنوویروسها، پـاروویروس
B19 انسانی و غیره)، نیستند .(1) همزمان با تلاش جهت روشن کردن این فرمهـای ناشـناخته، نیـشیزاوا1 و همکـارانش، بـرای نخستین بار در سـال 1997، ویـروس (2TTV) TT را در سـرم بیماران ژاپنی مبتلا بـه هپاتیـت بعـد از انتقـال خـون بـا منـشأ
نامشخص کـه سـطوح افـزایش یافتـه آلانـین آمینـو ترانـسفراز
1 Nishizawa 2 Torque Teno Virus
(ALT) را نشان میدادند و عـاری از ویـروسهـای هپاتیـت A
تا G بودند، شناسایی کردند TTV .(2) ویروسی بدون پوشش با
DNA تکرشتهای حلقوی است که طـول ژنـومش حـدوداً kb
3/8 و قطر آن 30- 32 نانومتر میباشد .(3- 5) این ویـروس از انتشار بالایی در سراسر جهان برخوردار است و مطالعات صـورت گرفته بـا اسـتفاده از سیـستمهـای 3PCR حـساس، همـراه بـا پرایمرهای طراحی شده برای مناطق بسیار محافظت شده ژنـوم ویروسی (4UTR)، حاکی از شیوع بـسیار بـالای (بـیش از 90٪)
آلودگی TTV در بین جمعیتهای عمومی سراسر جهان میباشد
.(6- 9) اگر چه در ابتدا تصور میشد کـه TTV تنهـا بـهوسـیله انتقال خون منتقل میشود، با توجه به شـیوع بـسیار زیـاد آن در جمعیتهای عمومی سراسر جهـان، همچنـین تـشخیص آن در نمونههای بیولوژیکی مختلف (پلاسما، مدفوع، بـزاق، ترشـحات گردن رحم، مایع آمنیوتیک، شـیر، پوسـت، اشـک و ...) احتمـال
3 Polymerase Chain Reaction 4 Untranslated region
زمستان 85، دوره نهم، شماره چهارم
TTV DNA
54 میزان شیوع ویروس TT در جمعیت شهر اصفهان
میرود که راههای مختلفی برای انتـشار آن وجـود داشـته باشـد
.(10- 17) بررســیهــا نتوانــستهانــد نقــش TTV را در بــدن، همچنین ارتباط آن را با بیماری کبدی یا هرگونه بیماری خـاص دیگری آشکار سازند 2) و 5 و 11 و (18 -28؛ چنانچه در بعضی از بررسیها نقـش TTV در بیمـاری کبـدی مثبـت 20) و 23 و (27 و در دیگر مطالعات منفـی 22) و 28 و (29 پیـشنهاد شـده است. در این مورد فرضیههای زیادی وجود دارد؛ مـثلاً پیـشنهاد شده است که تیپها یا تحت تیپهای معینـی از TTV ممکـن است هپاتوتروپیک باشند ( 24 و 30 و .(31 همچنین ارتباط بین میزان ویروس و وضعیت ایمنی میزبان مورد بررسی قـرار گرفتـه است 8) و 32 و .(33
امروزه هیچ تظاهر بالینی که بتـوان آن را مـستقیماً بـه TTV
نسبت داد، وجود ندارد. به هر حال کشف TTV به تازگی صورت گرفته است، درگیری آن در پـاتولوژی مـشخص و ارتبـاطش بـا میزبان بهصورت فرضیه اسـت و هنـوز مـوارد ناشـناخته زیـادی درباره آن وجود دارد.
با توجه به اینکه در آینده ممکن است نقش تیپهای خاصـی از این ویروس بهعنوان عامل بیماریزا مـشخص شـود، بررسـی وضعیت آلودگی بـه ایـن ویـروس در هـر جامعـهای از اهمیـت ویژهای برخوردار است. در ایـن ارتبـاط، در ایـن مطالعـه میـزان شیوع آلودگی TTV در جمعیت عمومی (افراد داوطلب اهداکننده خون) شهر اصفهان مورد بررسی قرار گرفت.
روش کار
132 نمونـه سـرمی از افـراد بـه ظـاهر سـالم 122) نمونـه) و
هپاتیتی 10) نمونه؛ شامل 6 نمونه مثبت Anti-HCV و 4 نمونه مثبت (HBs-Ag در 6 نوبت از تـاریخ 82/10/9 تـا 83/4/30 از بانک خون سازمان انتقال خون شهر اصفهان تهیه گردیدند و تـا زمان استفاده در دمای -20˚C نگهداری شدند.
بعد از تیمار شدن 200 میکرولیتر از هر نمونه سرمی با پروتئیناز
(0/5mg/ml) K در حـــضور (0/2M) NaCl و (%0/25) SDS
برای 2 ساعت در 65˚C، DNA بـا اسـتفاده از فنـل/ کلروفـرم/
ایزوآمیل الکل استخراج و با اتانول رسوب داده شد. نهایتاً رسوب خشک DNA در 100 تا 150 میکرولیتر از آب مقطر استریل یـا محلول1TEحل و در دمای -20˚C ذخیره گردید.
پرایمرها: پرایمرهای مورد استفاده در ایـن تحقیـق، T801 و T935 بودند که بهوسیله تاکاهاشی2 و همکارانش بـرای منطقـه
1 Tris -HCl buffer (10mM, pH=8.0) Containing 1mM EDTA 2 Takahashi
مجله پژوهشی حکیم
غیرکدکننده و بسیار محافظـت شـده ژنـوم ویروسـی (UTR) و
جهت تکثیر یک قطعه 199bp طراحی شدهاند .(9) با اسـتفاده از این پرایمرها، شناسایی تقرًیبا تمام ژنوتیپهای TTV امکانپذیر است. لازم به ذکر اسـت کـه پرایمرهـای مـورد نظـر T801) و (T935 توســط TIB MOLBIOL Syntheselabor آلمــان ساخته شدند.
PCR اسیدهای نوکلئیک استخراج شـده بـا اسـتفاده از آنـزیم Smar Taq DNA Polymerase (سـیناژن، ایـران) صـورت گرفت و برنامه PCR شامل یک دوره دناتوره شدن در 94˚C بـه مدت 5 دقیقه، 40 دوره تکثیر شـامل دورههـای دنـاتوره شـدن، الحاق و طویل شدن بهترتیب در 94˚C بهمـدت 20 ثانیـه، 57˚C
به مدت 25 ثانیه و 72˚C به مدت 30 ثانیـه و یـک دوره طویـل شدن نهـایی در 72˚C بـهمـدت 5 دقیقـه بـود. در ایـن مطالعـه نمونههای منفی دوباره مورد آزمـایش قـرار گرفتنـد، یعنـی هـم محصول PCR نمونههای منفی و هم خـود نمونـههـای DNA
استخراج شده، برای بار دوم در معرض PCR قرار گرفتنـد. بایـد خاطرنشان شود که در همه آزمایشها کنترل منفی بهکـار بـرده شد.
