بخشی از مقاله
بررسی بیان ژن سایتوکاین اینترلوکین 4 در موش BALB/c
حساس شده با ESAT-6 و CFP-10
چکیده
مایکوباکتریوم بویس عامل سل گاوي طیف وسیعی از میزبانها را به خود اختصـاص داده اسـت. پیشـرفت هـاي اخیـر در زمینـه ایمونولوژي و بیولوژي مولکولی باعث شناسایی تعداد زیادي از آنتی ژن هاي مایکوباکتریوم به منظور توسعه واکسنهـاي جدیـد شـده است .یکی از راههاي شناخت موثر بودن واکسن، بررسی بیان ژنهاي سایتوکاین سیستم ایمنی مـیباشـد. از آنجـا کـه اینترلـوکین 4 بارزترین سایتوکاین پاسخهاي Th2 است، لذا در این مطالعه، بیان ژن اینترلوکین 4 در موشهاي BALB/c بعد از انجام ایمونیزاسیون مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور 20 روز پس از تزریق، نمونههاي ماهیچه از گروههاي مـوش ایمـن شـده بـا پلاسـمید نوترکیـب ESAT-6 و CFP-10 و PPD گاوي و PBS و pcDNA3.1+ گرفته شد، RNA استخراج و به cDNA تبـدیل شـد، سـپس الگـوي بیان ژن اینترلوکین 4 با روش Real-Time PCR نسبی مورد سنجش قرار گرفت. نتایج نشان داد بیـان ژن در مـوشهـاي واکسـینه شده با پلاسمیدهاي نوترکیب در مقایسه با گروههاي کنترل به طور معنی داري کاهش داشت که مویـد عملکـرد سیسـتم ایمنـی در جهت الگوي Th1 است.
کلمات کلیدي: بیان ژن ، Real-Time PCR، اینترلوکین .4
مقدمه
بیماري سل گاوي یکی از زئونوزهاي مهم است که توسط پاتوژن مایکوباکتریوم بویس ایجاد میشود. این بیماري به لحاظ شیوع و زیان اقتصادي در واحدهاي دامپروري همواره مورد توجه محققین مختلف بوده است ( Tullius et al ., 2008; Souza et al.,2008;
.Pollock et al ., 2003)تکثیر و غلبه سلولهاي Th1 بر زیر گروه Th2 در ارگانهاي سیستم ایمنی با کنترل عفونت و محافظت در مقابل عامل عفـونیزا همراه بوده؛ در صورتی که تکثیر و غلبه سلولهاي Th2 بر زیر گروه Th1 در ارگانهاي سیسـتم ایمنـی همـراه بـا توسـعه عفونـت و پیشرفت عامل عفونیزا میباشد. تکثیر Th1 با ترشح سایتوکاینهاي نظیر IFN-γ، اینترلوکین 12و اینترلوکین 2 همراه خواهد بود. در صورتیکه تکثیر Th2 با تولید سایتوکاینهایی نظیر اینترلوکین 4، اینترلوکین 5 و اینترلوکین 10شناخته میشود and Ann,. 2002) .(Rogge نوع پاسخ سلولهاي ایمنی به صورت تحریک سلولی با اندازه گیري سـایتوکاینهـاي تولیـدي اینترفـرون گامـا in vitro و اینترلوکین 10 بررسی شده که آیا القاء سلولهاي ایمنی در برخورد با آنتیژن خارجی و یا عوامل عفونیزا به طرف Th1 یا Th2 سوق داده میشوند .(Spencer et al., 2005 ;Rogge and Ann., 2002)چگونگی بیان سایتوکاینها در سلولهاي T در پاسخ به آنتیژن،
نخستین مکانیسم دفاعی ایمنی سلولی میباشد که در پاسخهاي طبیعـی و بیمـاريهـا تـاثیر مـیگـذارد
.Godfrey et al 2004) این سایتوکاین، براي تمایز سلول Th2، تولید IgE، و فراخوانی ائوزینوفیل ضروري میباشد. به علاوه در رشد و تمایز لنفوسیتها، بازوفیـل، ماستوسـیت نقـش دارد و بلـوك کننـده تکامـل ماکروفاژهـا مـیباشـد .,2010; Ricci et al .,1997)
.(Lambert and Fauci
1
هدف از انجام تحقیق حاضر سنجش بیان ژن IL-4 در بافت ماهیچه موش BALB/c ایمن شـده بـا پلاسـمید نوترکیـب ESAT-6
و CFP-10 بود.
مواد و روشها
موشهاي ماده نژاد BALB/c با سن 8-6 هفته و میانگین وزن 30-25 گرم تحت شرایط یکسان نگهداري شدند. سپس تزریقات با استفاده از سرنگ انسولین به صورت داخل ماهیچهاي انجام شد و از بافر نمکی فسفات به عنـوان حامـل در حجـم 100 میکرولیتـر اســتفاده شــد. گــروه اول؛ PBS را دریافــت کردنــد، گــروه دوم، پلاســمید pcDNA3.1(+) و گــروه ســوم پلاســمید نوترکیــب pcDNA3.1(+)/ESAT-6 و گروه چهارم پلاسمید نوترکیب pcDNA3.1(+)/CFP-10 و گروه پنجم ترکیب دو پلاسمید نوترکیب گروه ششم PPD گاوي را به عنوان تیمار دریافت کردند. پس از 20 روز موشها با استفاده از کلروفـرم بیهـوش شـدند و نمونـه بافـت ماهیچه از محل تزریق تهیه شد. استخراج RNA توسط ترایزول صورت گرفت بلافاصله پس از استخراج RNA ساخت cDNA انجـام شد. بدین منظور در واکـنش سـاخت 2 :cDNA میکرولیتـر RNA اسـتخراج شـده،1 میکرولیتـر آغـازگر (20 pmol) Oligo dt، 1 میکرولیتر آنزیم MMLV reverse transcriptase، 4 میکرولیتر بافر 5 x MMLV-RT، 1 میکرولیتـر مخلـوط dNTPs دو میلـی-مولار، 0/5 میکرولیتر آنزیم RNase I، و آب تیمار شده با DEPC تا حجم واکنش 20 میکرولیتـر اسـتفاده شـد. برنامـه حرارتـی بـه صورت: 10 دقیقه در دماي 25 oC و 60 دقیقه در دماي 42 oC جهت سنتز و 10 دقیقه در -70 oC بهمنظور غیر فعال کـردن آنـزیم نسخهبردار معکوس استفاده شد سپس نمونهها در دماي -20 oC نگهداري شدند. بهمنظور بررسی بیان ژن در سطح RNA از تکنیکReal Time-PCR
نسبی استفاده شد. گروههاي تیمار و گروه هاي کنترل از نظر بیان ژن هدف و ژن GAPDH به عنوان ژن مرجع با انـدازهگیـري افزایش تشعشع فلورسنس در نتیجه اتصال رنگ SYBR Green توسط دستگاه (Rotor-Gene 3000 Corbett- Australia) ارزیابی شدند. نمودار سیکلهاي تکثیر در حین انجام واکنش Real Time-PCR براي ژن اینترلـوکین 4 و GAPDH بـه عنـوان ژن مرجـع ترسیم شد و دادهها بر اساس خط آستانه بصورت CT مشخص شدند. بهمنظور بررسی میزان بیان ژن آزمایش به صـورت طـرح کـاملاً تصادفی با چهار تکرار انجام گردید و جهت تجزیه آماري دادههاي آزمایش از نرمافزار Minitab 16 استفاده شد. مقایسه میانگینها بـا
آزمون توکی در سطح اطمینان 5 درصد صورت گرفت همچنین نمودارها با نرمافزار ترسم شدند.
نتایج و بحث
بعد از بهینهسازي دماي اتصال آغازگرها تکثیر قطعات اختصاصی ژن سایتوکاین IL-4 و GAPDH انجام شد. همـانطـور کـه در شکل 1 دیده میشود، محل تلاقی خط آستانه و منحنی تکثیر نشان دهنده چرخه آستانه (ct) بود که براي ژن IL-4 مورد نظر بخوبی مشاهده میشود.
نتایج بیان ژن اینترلوکین 4 در عضله مورد تزریق نشان داد پلاسمیدهاي نوترکیب بر میزان بیان ژن اثر معنیداري داشتند (P < .0/05) افزایش بیان ژن در گروههاي دریافت کننده تیمار PPD و ترکیب دو پلاسـمید نوترکیـب ES و CF بـه ترتیـب 2/41 و 2/49 برابر نسبت به گروه کنترل منفی بود (شکل.(2
2
