بخشی از مقاله
چکیده
محیطهای کشت معین دارای مزایای زیادی نسبت به انواع نیمه پیچیده و پیچیده برای تولید پروتئینهای نوترکیب دارویی هستند. در این تحقیق تاثیر اسیدهای آمینه سرین، لوسین، گلوتامیک اسید، اسپارتیک اسید و فنیل آلانین بر بیان و انتقال به فضای پری پلاسمی باکتری اشریشیاکلی نوترکیب در یک محیط کشت معین بررسی شده است. نتایج نشان داد که افزودن اسیدهای آمینه بر اساس موازنه جرمی، پس از القای کشت سبب جبران ضعف سلول برای بیان و انتقال پلاسمی شده و بازده رشد سلولی را ۵/۲ برابر افزایش می دهد
مقدمه
بر اساس طبیعت محیطهای کشت، آنها را به سه دسته با ترکیب شیمیایی مشخص یا معین١ ، با ترکیب شیمیایی نیمه پیچیده٢ و با ترکیب شیمیایی غیرمشخص یا پیچیده٣ تقسیمبندی میکنند. در محیطهای کشت شیمیایی مشخص، ترکیب شیمیایی و غلظت مواد مغذی محیط کشت کاملاﹰ مشخص و ثابت میباشد. در مقابل، ترکیب شیمیایی و کیفیت محیطهای کشت پیچیده و نیمه پیچیده، نامشخص و متغیر است که این عامل موجب کاهش تکرارپذیری فرایندهای تخمیری میشود.
استفاده از محیطهای کشت شیمیایی مشخص دارای مزایای متعددی نسبت به محیطهای کشت پیچیده میباشد که از آن جمله میتوان به امکان افزایش تکرارپذیری و ثبات فرایند تخمیر، اندازهگیری و کنترل بهتر شرایط تخمیر، بهبود عملیات افزایش مقیاس، بهبود فرایندهای پاییندستی و مطابقت با قوانین و مقررات عملیات تولید بهینه٤ جبقنض اشاره کرد
فاکتور تحریک کننده کلنی های گرانولوسیت و ماکروفاﮊ یک گلیکوپروتئین١٤ تا ٣٥ کیلو دالتونی است که میتواند تکثیر و تمایز سلولهای زاینده گرانولوسیت و ماکروفاﮊ را تحریک کند - ۳ - . این پروتئین در درمان بیماریهایی نظیر کمی تعداد سلول های خونی، درمان سندرم های نقصان مغز استخوان و افزایش تعداد و توان گرانولوسیتها در بیماران ایدزی به کار می رود
باکتری اشریشیاکلی بواسطه رشد سریع، خصوصیات مشخص و قابلیت بیان پروتئین در موقعیت های مختلف سلولی نظیر سیتوپلاسم، پری پلاسم، سطح سلول و انتقال به محیط کشت یکی از مناسبترین میزبانها برای تولید پروتئینهای نوترکیب است
یکی از موقعیت های مناسب برای بیان پروتئین در باکتری اشریشیاکلی، فضای پری پلاسمی است. این فضا بین غشای سیتوپلاسمی و دیواره سلولی باکتری های گرم منفی قرار دارد. ترشح پروتئین هدف به فضای پری پلاسمی راهکار مطلوبی است که علاوه بر تسهیل فرایندهای پایین دستی سبب تقویت ساختار پروتئین و محافظت در مقابل تجزیه پروتئولیتیکی می شود
چند مسیر برای انتقال پروتئینها از سیتوزول به فضای پری پلاسمی شناسایی شده که عبارتند از: مسیر وابسته به Bطکح، مسیر وابسته به ذره شناساگر جبلحضو مسیر ؟طAسغط1w که اخیراﹰ مورد بررسی قرار گرفته است .
در مسیر وابسته به - به عنوان مثال زمانی که از پپتید نشانه pelB در بالادست ﮊن مولد پروتئین هدف استفاده می شود - ، ابتدا چاپرون به ناحیه بالغ پیش پروتئین متصل شده و آن را به غشای سیتوپلاسمی و در مجاورت پروتئین سطحی هدایت می کند. پروتئینی است با خاصیت ککهبA1 و جزو پروتئینهای سطحی غشا که به پپتید نشانه و ناحیه بالغ پیش پروتئین متصل شده و انرﮊی حاصل از هیدرولیز بA1 را برای انتقال پیش پروتئین به کانال عرضی تأمین مینماید. چرخه تکراری اتصال به پیش پروتئین، اتصال و هیدرولیز بA1 و انفصال از پیش پروتئین تا زمانی که کل پیش پروتئین از عرض غشاﺀ عبور کند، ادامه می یابد
معمولا از راهکارهایی چون بهینه سازی محیط و روش کشت، اصلاح سویه میزبان و کنترل سیستم بیانی برای بهینه سازی تولید پروتئین های نوترکیب استفاده می شود - ۷ - . در بسیاری از موارد محیط کشتهای معین جوابگوی بیان بالا در پروتئینهای سیتوپلاسمی هستند - ۸ - . اما در تولید پروتئینهای پری پلاسمی اغلب محیط کشتهای پیچیده و یا نیمه پیچیده استفاده می شود - ۹ - . انتقال پروتئین به فضای پری پلاسمی یک فرایند انرﮊی خواه است و در برخی موارد محیط کشت معین قادر به تامین این انرﮊی نیست و بایستی محیط کشت با استفاده از ترکیباتی مثل عصاره مخمر، پپتون و غیره غنی سازی شود - ۹ - . در برخی از تحقیقات برای افزایش بیان پروتئینهای سیتوپلاسمی نوترکیب از افزایش جهت دار اسیدهای آمینه استفاده شده است
پژوهشهای گذشته نشان داد که انتقال ًحهسقنلا به فضای پری پلاسمی با استفاده از محیط کشت معین حاوی گلوکز - به عنوان منبع کربن - امکان پذیر نیست - ۹ - . بنابراین در این تحقیق تاثیر افزایش جهت دار اسیدهای آمینه روی بیان و انتقال ًحهسقنلا برای دستیابی به یک محیط کشت معین بررسی شده است.
مواد و روشها
میکروارگانیسم
باکتری مورد استفاده به کانامایسین بود که باکتری در دمای ٧٠-E. coli حامل پلاسمید دارای ﮊن های hgm-csf و مقاومت در پژوهشگاه ملی مهندسی ﮊنتیک و زیست فناوری ساخته شده است - ۲۱ - . این درجه سانتی گراد پ نگهداری می شد
محیط کشت
محیط کشت آگار حاوی ۰۱ گرم پپتون، ۵ گرم عصاره مخمر، ۰۱ گرم و ۵۱ گرم آگار به ازای یک لیتر محیط برای کشت باکتری در پلیت استفاده شد. محیط کشت مورد استفاده در فرمانتور حاوی ۶۹/۹۱گرم ، ۶ گرم ، ۲/۱ گرم ، ۰۴ گرم گلیسرول به عنوان منبع کربن و عناصر کم مقدار با ترکیب ۱/۴۱ میلی گرم 1Aخغ، ۵/۲ میلی گرم ، ۵۱ میلی گرم ، ۵/۱ میلی گرم ، ۳ میلی گرم صقBصد، ۱/۲ میلی گرم ، ۸/۳۳ میلی گرم و ۸/۰۰۱ میلی گرم در لیتر بود - ۳۱ - . یکی از کشتها با استفاده از غلظت ۰۱ گرم در لیتر پپتون غنی شد. محیط کشتها در دمای هپ ۱۲۱ به مدت ۵۱ دقیقه اتوکلاو شدند.
برای تهیه مایه تلقیح، کلنی رشد کرده از پلیت Bع آگار به محیط کشت معین - محیط فوق بدون پپتون با غلظت ۵۱ گرم در لیتر گلیسرول - منتقل شده و به مدت ۴۱ ساعت در دمای هپ۰۳ با سرعت ۰۵۲ دور در دقیقه هم زده شد. بذر حاصل برای تلقیح به فرمانتور استفاده شد.
