بخشی از مقاله
چکیده
سرطان یکی از مشکلات اصلی سلامت انسانها محسوب شده و سالانه موجب مرگ میلیونها نفر میشود. امروزه، روشهاي مختلفی براي درمان سرطان وجود دارد. هر یک از این روشها مشکلات و نارساییهایی دارند. گیاهان به دلیل داشتن ترکیبات فیتوکمیکال، پتانسیل بالایی در درمان بسیاري از بیماريها از جمله سرطان دارند. در واقع، برخی داروهاي ضد سرطان با منشاء گیاهی از قبیل Taxol، Vinblastine و Vincristine در حال حاضر در کلینیک مورد استفاده قرار میگیرند. در طب سنتی، از انار براي درمان بیماريهاي مختلف استفاده میشود.
دانههاي انار براي درمان اسهال و عصارهي میوهي آن بعنوان یک سردکننده و نیز تقویت کنندهي خون مورد استفاده قرار میگیرد. امروزه از انار و مشتقات آن علاوه بر استفادههاي آرایشی و بهداشتی، براي درمان بیماريهایی مانند AIDS، بیماریهاي قلبی، فشار خون و همچنین سرطان استفاده میشود. در این مطالعه که از سلولهاي سرطانی PC-3 استفاده شد، مشخص شد عصاره استونی میوه انار، موجب افزایش بیان ژن CDH1 در سطح رونویسی و همچنین افزایش بیان پروتئین β-catenin میشود. پروتئین β-catenin و E-cadherin در اتصالات سلولی Adherens junction شرکت میکنند. بنابراین میتوان گفت میوه انار احتمالا، پتانسیل بالایی در مهار تهاجم سلولهاي سرطانی دارد.
-1 مقدمه
کادهرینها، گلیکوپروتئینهایی هستند که در اتصالات بین سلولی شرکت میکنند. از آنجاییکه پروتئینهاي Cadherin با اکتین اسکلت سلولی برهمکنش دارند، بنابراین در انتقال پیام سلولی از سطح سلولی و تغییر مورفولوژي و سایر فرایندهاي سلولی نقش دارند . - Pettitt, 2005 - از جمله این پروتئینها میتوان به E-cadherin اشاره کرد که در سطح سلولهاي اپیتلیال بیان میشود.
این پروتئین که توسط ژن CDH1 ساخته میشود یکی از مارکرهاي سطحی سلول-هاي اپیتلیال بوده و در اتصالات سلولی Adherens junction بین این سلولها شرکت میکند. از طرفی این پروتئین از طریق بخش سیتوپلاسمی خود با پروتئین β-catenin برهمکنش داده و با اسکلت سلولی در ارتباط میباشد. بنابراین در صورت افزایش میزان هر یک از این دو پروتئین در محل اتصالات Adherens junction در سطح غشاء سلولی، مقدار پروتئین دیگر نیز افزایش مییابد . -
در بسیاري از سرطانهاي بافتهاي اپیتلیال، بیان ژن سازنده E-cadherin کاهش یافته و یا متوقف میشود. بنابراین
اتصالات بین سلولها ضعیف شده و پدیده مهاجرت و متاستاز سلولهاي سرطانی براه میافتد. بیان پروتئین E-
cadherin در سلولهاي سرطانی، همچنین موجب بروز پدیده EMT 1 میشود
در این پدیده، سلولهاي اپیتلیال مورفولوژي قطبی و ورقه-اي خود را از دسته داده و مورفولوژي سلولهاي مزانشیمی با قابلیت مهاجرت را به خود میگیرند. بنابراین یکی از راههاي مهار متاستاز سلولهاي سرطانهاي اپیتلیال القاء بیان ژن سازنده E-cadherin و تقویت اتصالات سلولی Adherens junction است .
سلولهاي PC-3 یکی از سلولهاي مورد استفاده در تحقیقات مربوط به سرطان پروستات میباشد که در زمینه مطالعه تاثیر داروها و پاسخ آنها به داروها سلولهاي مناسبی میباشند. این سلولها، مزانشیمی دوکی شکلی هستند که قدرت تهاجمی بالایی دارند . تاکنون مطالعات زیادي جهت مهار متاستاز سلولهاي سرطانهاي اپیتلیال صورت گرفته است ولی دارویی که قابلیت مهار متاستاز را داشته باشد تاکنون شناسایی و معرفی نشده است.
میوهها، سبزیجات و ادویهها به دلیل توانایی در مهار سرطان - مراحل مختلف تشکیل و گسترش سرطان - مورد توجه محققین قرار گرفتهاند. بخصوص میوهها و سبزیجات غنی از مواد ریز مغذي از جمله فیبر، انواع ویتامینها و مواد معدنی و همچنین ترکیباتی نظیر پلی فنلها، ترپنها، آلکالوئیدهامیباشند که سرطان را مهار میکنند
انار یکی از میوههایی است که در مورد اثرات ضد سرطانی آن مطالعات زیادي انجام شده است. خواستگاه اولیه گیاه انار، ایران است و به تدریج به چین، هند، شمال آفریقا، اروپا و کشور امریکا گسترش پیدا کرده است . - Ebadi, 2007 - در پزشکی سنتی هند، از انار به عنوان یک داروخانه یاد میشود . تاکنون مطالعات زیادي در مورد اثرات ضد سرطانی انار صورت گرفته و گزارشات محدودي در زمینه تاثیر مهاري عصاره انار بر تهاجم سلولهاي سرطانی ارائه شده است.
در این مطالعه ما به بررسی اثر عصاره متانولی بخش خوراکی بر رونویسی ژن CDH1 و همچنین تاثیر این عصاره بر میزان پروتئین β-catenin در سلولهاي PC-3 پرداختیم. مطالعات اولیه ما نشان داد که ژن CDH1 در سلول- هاي PC-3 در سطح بسیار پایینی بیان میشود. بنابراین به نظر میرسد سلوهاي PC-3 مدل مناسبی براي مطالعه تاثیر ترکیابت و داروهاي مختلف بر بیان ژن سازنده E-cadherin و تهاجم سلولی باشند. نتایج آزمایشات ما نشان داد که عصارهي میوه انار موجب افزایش بیان ژن CDH1 در سطح رونویسی میشود. همچنین این مطالعه مشخص کرد که عصاره موجب افزایش میزان پروتئین β-catenin سلولی میشود. قصد داریم مطالعات خود را در مورد مکانیسم اثر عصاره انار بر بیان ژن هاي هدف پروتئین β-catenin و نیز اثر آن بر بیان E-cadherin در سطح پروتئین گسترش دهیم.
-2 مواد و روشها:
-1-2 کشت سلولها:
رده سلولی PC-3 از بانک سلولی انیستیتو پاستور ایران خریداري شد. سلولها در محیط کشت RPMI-1640 حاوي %10 سرم گاوي - Invitrogen - ، آنتی بیوتیک استرپتومایسین - 100 µg/ml - و پنی سیلین - 100 unit/ml - کشت داده شدند.
-2-2تهیه عصاره از بخش خوراکی میوه انار:
بخش خوراکی - دانه - انار از پوست جدا شده و در محلول استن - %70 به نسبت حجمی - 1:15 قرار داده شد. مخلوط حاصله با کمک دستگاه آبمیوهگیري آشپزخانه به مدت 30 دقیقه مخلوط شد. سپس به مدت 24 ساعت روي شیکر قرار داده شد تا کاملا هم بخورد. سپس مخلوط حاصله از صافیهاي مختلف عبور داده شد تا رسوب و ذرات آن از بخش مایع جدا شوند. سپس محلول حاصله تغلیظ شده و با استفاده از دستگاه Freeze-dryer، عصاره بصورت پودر درآمد. از این عصاره غلظت 20 mg/ml تهیه شد و به همراه بقیهي پودر تا زمان استفاده در دماي -20ºC نگهداري شد.
-3-2 تیمار سلولهاي PC-3 با عصاره:
تعداد 4×104 سلول PC-3 در هر یک از چاهکهاي شش خانهاي کشت داده شدند، پس از 48 ساعت، سلولها با غلظتهاي 10 µg/ml و 25 µg/ml عصاره میوه انار تیمار شدند. پس از 24 ساعت، محیط کشت سلولی تعویض شده و مجدداً عصاره با غلظتهاي قبلی به هر چاهک اضافه شد و به مدت 24 ساعت دیگر سلولها انکوبه شدند.
-4-2 استخراج RNA و آزمایش :RT-PCR
پس از تیمار سلولها با 10 µg/ml و 25 µg/ml عصاره به مدت 48 ساعت، با استفاده از EDTA-Trypsin، سلولها از پلیتها جدا شده و استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA شرکت سیناژن - RNXPlus - انجام شد. پس از سنجش غلظت RNA استخراجی با دستگاه نانودراپ، به میزان 2 میکروگرم از RNA براي ساخت cDNA مورد استفاده قرار گرفت.
با استفاده از پرایمرهاي ویژه ژن سازنده E-cadherin، بیان این ژن در سلولهاي تیمار شده با غلظتهاي مختلف عصاره میوه انار مورد مطالعه قرار گرفت. جدول 1، پرایمرهاي مربوط به ژن CDH1 و β-actin را نشان میدهد. جدولهاي2 و 3 مشخصات برنامه زمانی واکنش PCR براي ژنهاي E-cadherin و β-actin را نشان میدهند.
