بخشی از مقاله
چکیده
به منظور تعیین اثر آنتیاکسیدانی عصاره علف چشمه بر تحرک پیش رونده اسپرم، از 15 خروس نژاد راس 308 نمونهگیری شد. نمونهها بعد از تجمیع با رقیقکننده سکستون رقیق و به پنج قسمت تقسیم شدند و به هر قسمت مقدار صفر - شاهد - ، 300، 600، 900 و 1200 میکروگرم در میلیلیتر عصاره علف چشمه اضافه شد. سپس نمونهها به مدت 72 ساعت در در دمای 4 C نگهداری شدند. نتایج نشان داد که در زمان های 48 و 72 دخیره سازی اسپرم، اختلاف معنیداری در تحرک پیش رونده بین مقدار 600 میلیگرم علف چشمه با گروه شاهدوجود داشت. بنابراین افزودن 600 میلی گرم عصاره علف چشمه در طی ذخیرهسازی اسپرم پیشنهاد میشود.
واژههای کلیدی: اسپرم خروس،آنتیاکسیدانت، پراکسیداسیون
مقدمه
تلقیح مصنوعی مهمترین تکنیککمکیتولیدمثلی در پیشبرد اهداف توسعه نژادها و پیشرفت ژنتیکی میباشد 15] و .[19ازکاستیهای تلقیح مصنوعی، کاهش قدرت باروری اسپرمها با افزایش مدت نگهداری، در پی اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع و تشکیل رادیکالهای آزاد است. در نتیجه برای کاهش اثرات مضر رادیکالهای آزاد از مواد آنتی اکسیدانی استتفاده میشود.از روشهای نگهداری برونتنی اسپرم پرندگان، نگهداری منی به صورت مایع است که همواره سعی شده است با افزودن ترکیبات آنتیاکسیدان به رقیقکنندهها[5]، باروری اسپرمها در مدت نگهداری به صورت مایع حفظ شود.[11]
از رقیقکنندههایی که به طور گسترده در تحقیقات مربوط به نگهداری برونتنی منی پرندگان به صورت مایع مورد استفاده قرار گرفته است میتوان به رقیقکننده بلتسویل1یا سکستون اشاره کرد.[13]حرکت پیش رونده اسپرم از جمله فاکتورهای اصلی به منظور تلقیح برون تنی پرندگان است. فسفولیپیدها از ترکیبات اصلی غشا بوده و عامل اصلی سیالیت آن هستند که این خصوصیت در فرایند ظرفیتپذیری و واکنش آکروزوم در پستانداران و جنبایی در اسپرمهای انسان، خوک و خروس بسیار حائز اهمیت است .[28] بهمنظور کاهش پراکسیداسیون اسیدهای چرب غشای اسپرم سه سطح محافظتی بهطور طبیعی وجود دارد که عبارتند از: الف - آنزیمهای آنتیاکسیدان مانند سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز ب - آنتیاکسیدانهای محلول در آب و یا چربی مثل ویتامینهای C، A، E و اسید اوریک ج - فسفولیپازها، پروتئازها و ترانسفرازها که مسئول ترمیم غشا و حذف ترکیبات حاصل از پراکسیداسیون لیپیدهای غشا هستند.
اسپرم در خلال فرآیند اسپرمسازی، مقدار زیادی از سیتوپلاسم خود را از دست میدهد و از آنجا که بیشتر آنزیمها در سیتوپلاسم سلول است، بنابراین اسپرم ظرفیت آنتیاکسیدانی اندکی دارد و هنگام یخزدن دچار آسیبهای فیزیکی و شیمیایی میشود. شوک سرمایی وارد شده به اسپرم، با تنش اکسیداتیو ناشی از رادیکالهای اکسیژندار در ارتباط است به همین دلیل افزودن آنتیاکسیدان به مایع رقیقکننده قبل از یخزدن اسپرم، آسیبهایاحتمالی پس از یخگشایی را نیزکاهش میدهد ولی سیستم آنتیاکسیدانی موجود در منی پرندگان اهلی در تولیدمثل طبیعی تنها برای مدت کوتاهی موثر است.[6] علف چشمه گیاهی دائمی از خانواده کراسیفرا یا چلیپائیان است.[1]
این گیاه دارای مقادیر قابل توجه از ترکیبات فنولی مثل کاروتنوئیدها، بتاکاروتن، لوتئین، زئاگزانتین و فلاوونوئیدکوئرستین است.[16] فلاوونوئیدها پلیفنل های محلول در آب هستند[8] که دارای بیشترین قدرت آنتی اکسیدانی هستند[23]، که به محافظت از سلولها در برابرآسیب های ناشی از رادیکال های آزاد کمک می کند.[17] در ضمن علف چشمه دارای خاصیت ضد ویروسی [20]ضد باکتریایی و ضد قارچی است.[14] و سبب کاهش آسیب اکسیداتیو DNA و دارای اثرات ضد تکثیری روی سلولهای تومور است [21]بنابراین هدف از این تحقیق تعیین بهترین غلظت عصاره علف چشمه جهت ذخیرهسازی اسپرم خروس در دمای 4 درجه سانتی گراد بود.
مواد و روشها
برای اجرای این تحقیق از 15 قطعه خروس سالم نژاد راس 308 با سن 32 هفتگی استفاده شد. خروسها در قفسهای انفرادی در دمای 18-20 درجه سانتیگراد و تحت یک برنامه نوری با 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت تاریکی نگهداری شدند.آب به صورت آزاد و جیره غذایی بر اساس توصیه شرکت راس در اختیار پرندهها بود. در پرندگان فاقداسکروتال بوده و بیضه در داخل بدن قرار دارد و برای تحریک بیضه از روش مالش شکمی استفاده گردید. هدف از مالش، انتقال نیروی مکانیکی به حفره شکمی است و وجود یک دورهی عادت پذیری ضروری است وگرنه احتمال دریافت پاسخ در همان آغاز کار، بسیار اندک است.
برای خروس میانگین دوره عادت پذیری 10-12 روز است البته بعضی خروس ها در همان روز نخست نمونه می دهندولی بعضیها حتی تا پایان دوره هم نمونه نمی دهند. برای نمونهگیری ابتدا باید خروس سالم و دارای توان تولیدمثلی بالا را انتخاب کنیم نمونههای منی پس از 10 روز - عادتدهی - و با روش مالش شکمی در 5 نوبت - تکرار - ، جمعآوری شد. در روز نخست پاهای خروس را بین پاهای مان مهار کرده و فقط نوازش در ناحیه سر و سوت زدن انجام شد. در روز دوم پرهای ناحیه کلوآک را کنده وبا مالش دادن، اعصاب پاراسمپاتیک را تحریک کرده که سبب بیرون زدگی کلوآک شد که معادل ارکسیون1در پستانداران است.
با دست چپ، مالش از ناحیهبال آغاز و به سمت دُم میرود و با دست راست از جایی که بخش پسین ماهیچهی سینه است مالش آغاز شده و به حفره شکمی که رسید فشار بیشتر میشود - برووز و گوئین، . - 1973 در حین مالش، بیرون زدگی کلوآک ایجاد می شود که قسمت مرکزی آن پاپیلاست. با انگشتان شست و اشاره دست چپ که روی کلواک جمع شد نمونه منی به بیرون از بدن پرنده ریخته شد. نمونهها بالوله جمع آوری منی که همدما با دمای داخلی بدن خروس است - 41 C - جمعآوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. سپس در آزمایشگاه بخشی از نمونه منی به نسبت 1 به 200 توسط آب رقیق شده و با لام هموسایتومتر تعیین غلظت شد.
در ادامه منی با رقیقکننده سکستون که هم-دما با مایع منی است به نسبتی رقیق شد تا غلظت اسپرم آن به دو برابر غلظت نهایی - 4 ×109 اسپرم در میلیلیتر - برسد - لموئین و همکاران، 10 . - 2011 میکرولیتر از محلول پایه بوسیله بافر سکستون به حجم 10 میلیلیتر رسانده شد تا محلول کار با غلظت 400 میکروگرم در میلیلیتر عصاره علف چشمه و 0/1 درصد اتانول تهیه شود. در ادامه نمونههای منی به 5 قسمت مساوی تقسیم شدند و به هر بخش، رقیقکننده سکستون حاوی صفر، 600، 1200، 1800 و 2400 میکروگرم در میلیلیتر عصاره علف چشمه به صورت حجم به حجم 1:1 اضافه شد.
غلظت نهایی اسپرم به 2000106 در mL و عصاره علف چشمه به صفر - شاهد - ، 300، 600، 900 و 1200 میکروگرم در میلیلیتر رسید. بعد از رقیقسازی، تیمارها توسط کرایباکس به دستگاه تست چمبر جهت سردسازی منتقل شدند. این دستگاه با نرخ سردسازی 0/25 درجه در دقیقه، دما را از 39 به 4 C رسانده و نمونهها به مدت 72 ساعت دراین دما ذخیره شدند.10 میکرولیتر از نمونه منی به نسبت 1 به 3 با رقیقکننده سکستون رقیق شد. سپس 5 میکرولیتر از آن را روی یک لام با دمای 39 درجه قرار داده و با گذاشتن یک لامل روی آن، تحرک اسپرم بررسی شد.
تحرک اسپرم توسط میکروسکوپ اختلاف فاز مجهز به صفحه گرمایی با بزرگنمایی × 400 به روش سابجکتیو [4] بررسی و به صورت درصد تحرک پیش-رونده بیان شد. نتایج بدستآمده از تحرک پیشرونده در این پژوهش در قالب طرح کاملا تصادفی و به صورت دادههای تکرار شده در زمان با استفاده از نرم افزار SAS و رویه Mixed آنالیز شدندو به صورت Mean - SE ارائه و سطوح معنیداری در سطح - - P < 0.05 بررسی شد. اجزای رقیقکننده سکستون یا 1BPSE در جدول 1 نشان داده شده است. بود[24]
نتاج و بحث
-1اثر مستقل عصاره علف چشمه و زمان ذخیره سازی اسپرم بر تحرک پیش رونده اسپرمبا توجه به نتایج، اثر مستقل عصاره علف چشمه بر تحرک پیش رونده معنی دار بود - جدول . - 2 بیشترین تحرک پیش رونده اسپرم مربوط به مقدار 600 میکروگرم علف چشمه بوده و اختلاف معنی داری با گروه شاهدمشاهده شد . - p<0/05 - بین مقدار 300 میکروگرم عصاره علف چشمه ومقدار900 میکروگرم علف چشمه با گروه شاهد اختلاف معنیداری مشاهده نشد . - P>0/05 - همچنین کمترین تحرک پیش رونده اسپرم مربوط به مقدار 1200 میکرگرم علف چشمه بوده وتفاوت معنی داری با گروه شاهد و سایر مقادیر علف چشمه مشاهده شد - . - p<0/05
