بخشی از مقاله
چکیده:
پروتئازها یکی از مهم ترین آنزیم های کاربردی در بیوتکنولوژی و صنایع مختلف مانند صنایع چرم، صنایع غذایی، داروسازی، می باشند. کورکومین از خانواده زنجبیل، دارای خواص درمانی مفیدی از جمله خاصیت آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی، خاصیت ضد سرطانی و غیره است. در این تحقیق فعالیت آنزیم تریپسین درحضور غلظت های مختلفی از کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم تریپسین در حضور غلظت های بالا از کورکومین کاهش می یابد.
.1 مقدمه
کورکومین یا دی فولیل متان - - C12H20O6 از ریزوم گیاه زردچوبه مشتق شده که یک پلی فنول هیدروفوب می باشد. گیاه زردچوبه به صورت سنتی در صنایع غذایی و دارویی دارای مصارف زیادی است. همچنین این ماده رنگ زرد مناسبی داشته به همین علت در صنایع غذایی به عنوان عامل رنگ دهنده به کار می رود . - 1 - شکل 1 ساختار شیمیایی کورکومین را نشان می دهد. پروتئازها آنزیم هایی می باشند که با تبدیل مولکول های پروتئین به پپتیدها و اسید های آمینه واکنش هیدرولیزی را کاتالیز می کنند .
آنزیم تریپسین یک سرین پروتئاز بوده و رزیدوهای هیستیدین 57، آسپارتیک اسید 102 و سرین 195، رزیدوهای کاتالیزوری آنزیم اند .
این آنزیم معمولا در موجودات عالی دیده می شود و به طور محدودی در باکتری ها یافت می گردد، این آنزیم در سیستم گوارش اکثر مهره داران یافت می شود و از جمله آنزیم هایی است که در فرایندهای بیوتکنولوژی کاربرد فراوان دارد .
تریپسین داری فعالیت اندوپپتیدازی بوده و زنجیره پروتئینی را از بخش کربوکسیلی اسید آمینه های آرژنین و لیزین هیدرولیزکرده و نقش مهمی در فرایند های زیستی مانند هضم موادغذایی دارد. از جمله کاربردهای دیگر تریپسین می توان به استفاده از آن در شیمی بالینی جهت آنالیز مواد غذایی اشاره کرد - 5،. - 6 به طور معمول در تحقیق بر روی آنزیم تریپسین از نوع گاوی و یا خوکی استفاده می شود. هدف از این تحقیق ارزیابی فعالیت آنزیم تریپسین در حضور غلظت های مختلف از کورکومین خواهد بود.
شکل :1 ساختار شیمیایی کورکومین
.2 مواد و روش ها
.1-2 در این تحقیق از تریپسین خوکی استفاده شد. این آنزیم به همراه تمام مواد مورد استفاده از شرکت مرک خریداری شد. ماده ی کورکومین از شرکت سیگما خریداری شد. برای اندازه گیری جذب نمونه ها از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ - کمپانی ترمو - مدل UV- Vis استفاده شد.
.1-1-2 تعیین فعالیت آنزیم تریپسین
برای تعیین فعالیت آنزیم ، غلظت 100 J/PO از آنزیم در بافرتریس 20 Mm با pH=8 تهیه شد. محیط واکنش آنزیمی شامل محلول یک درصد از کازئین در بافرتریس 20 Mm با pH=8 بوده که به منظور برهمکنش کورکومین با آنزیم تریپسین ، ابتدا غلظت های مختلفی ازکورکومین با آنزیم تریپسین انکوبه شد و سپس به محیط واکنش آنزیمی شامل کازئین اضافه گردید. بعد از گذشت زمان انکوباسیون 60 دقیقه ، با افزودن محلول ده درصد از تری کلرواستیک اسید - TCA - واکنش های آنزیمی متوقف گردید. تری کلرو استیک اسید علاوه بر این که باعث متوقف شدن فعالیت آنزیمی می شود قطعات بزرگ پپتیدی را که در محیط واکنش آنزیمی موجود می باشند را نیز رسوب می دهد.
در این شرایط، قطعات پپتیدی حاصل از فعالیت آنزیم ، در محلول رویی مانده و میزان جذب نوری آن ها در 280 نانومتر سنجیده شد. - این جذب نشان دهنده ی میزان فعالیت آنزیم می باشد - . برای دست یابی به محلول رویی شفاف، رسوب حاصله توسط سانتریفیوژ در دور g 20000 و به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد ته نشین گردیده و مقدار جذب محلول روئی توسط نانودراپ در طول موج 280 نانومتر اندازه گیری گردید . - 7 - یک واحد از فعالیت پروتئاز، به صورت مقدار آنزیمی که بتواند در مدت یک دقیقه در دمای 25 درجه سانتی گراد یک میکرومول تیروزین آزاد کند، تعریف می شود .
.2-1-2 تعیین فعالیت آنزیم تریپسین در حضور غلظت های مختلفی از کورکومین
فعالیت آنزیم در حضور کورکومین با تهیه غلظت های مختلفی از آن در محیط واکنش آنزیمی مورد ارزیابی قرار گرفت. در طول آزمایش، محیط واکنش آنزیمی باید دارای pH=8 باشد. غلظت های تهیه شده از کورکومین عبارتند از: 20 J/PO، 40 J/PO، 60 J/PO، .80 J/PO شکل2 میزان فعالیت آنزیم تریپسین در حضور غلظت های مختلف از کورکومین را نشان می دهد.
شکل :2 میزان جذب نوری آنزیم تریپسین در حضور کورکومین تحت شرایط واکنش استاندارد. شرایط واکنش: نسبت 1 به 1 از آنزیم تریپسین و کورکومین. دمای 25 درجه سانتی گراد، زمان یک ساعت انکوبه و .pH= 8
در شکل 2 فعالیت آنزیم تریپسین - ارزش جذب نوری شناسایی شده در 280 نانومتر - از 0/26 بدون حضور کورکومین به 0/1 در حضور غلظت 80 J/PO کورکومین کاهش یافته است. جدول یک میزان فعالیت آنزیم و درصد مهار شدن آن را در حضور غلظت های مختلف کورکومین نشان می دهد.
جدول :1 مقایسه بین فعالیت آنزیم و فعالیت اختصاصی آن بدون حضور کورکومین در محیط واکنش با فعالیت آنزیم در حضور غلظت های مختلف از کورکومین بعد از یک ساعت انکوباسیون در دمای 25 درجه سانتی گراد. - همبستگی در سطح 0/01 معنادار است -
. 3 یافته ها
مطالعه اولیه اثر کورکومین بر روی آنزیم تریپسین انجام شد. فعالیت آنزیم تریپسین مخلوط شده با کورکومین در حضور غلظت های بالا از کورکومین به طور معنی داری کاهش یافت. طیف سنجی UV-vis نشان می دهد که کورکومین با اتصال به آنزیم مانع از دسترسی آن به سوبسترای خود یعنی کازئین می شود درنتیجه فعالیت آن کاهش می یابد.
