بخشی از مقاله
چکیده
ژن پروستوگلندین اندوپراکسیدسنتاز - PTGS2 - 2 کد کننده ی آنزیم PTGS2 است که این آنزیم در مسیرهای متابولیسمی اسیدهای چرب موجود در سلول های اپپیتلیال پستانی گاوها نقش کلیدی دارد. این پژوهش به منظور بررسی رفتار فرم های مختلف آللی در ناحیه ی 3"UTR ژن PTGS2 در گاوهای نژاد هلشتاین و مونبلیارد صورت گرفت.
در این طرح از 200 راس گاو هلشتاین و 100 راس گاو مونبلیارد به صورت تصادفی خونگیری شده و DNA نمونه های خون استخراج گردید. برای تعیین کیفیت DNA از ژل آگارز یک درصد استفاده شد . ناحیه ی 3"UTR ژن PTGS2 با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر و محصولات PCR توسط روش SSCP آنالیز شدند. محصولات PCR توسط الکتروفورز با ژل پلی آکریلامید 10 درصد و رنگ آمیزی نیترات نقره آشکار گردید. نتایج SSCP محصولات PCR نشان دادند که در این ناحیه ی تنظیمی جهشی وجود ندارد.
مقدمه
PTGS21 که در گذشته سیکلو اکسیژناز - COX-2 - یا PGH2 سنتاز2 نامیده میشد - Sheldrik et al., 2007 - در سال 1991 در آزمایشگاه Daniel Simmon در دانشگاه Brigham Young کشف شده است . - Xie et al., 1991 - ژن کد کنندهی این آنزیم روی کروموزوم 16 گاو قرار داشته و طول ناحیهی 3"UTR آن 1564 جفت باز است. این آنزیم که توسط ژن PTGS2 کد میشود، آراشیدونیک اسید را به پروستوگلندین H2 تبدیل میکند که یک مرحلهی مهم در سنتز پروستانوئیدها است . - Kim et al., 2005 - پروستانوئیدها گروهی از آیکوزانوئیدها هستند که از اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع تشکیل میشوند.
این ترکیبات خانوادهای از پیام رسانهای بیولوژیکی هستند که در زمان کوتاهی بر روی سلولهای نزدیک بافتی که آنها را تولید کرده است، اثر میکنند و در ایمنی و التهاب نقش دارند. آیکوزانوئیدها در سلولها ذخیره نمیشوند بلکه در موارد نیاز به سرعت از اسیدهای چرب غشای سلول یا غشای هسته که عمدتا اسیدهای چرب امگا 3 و یا امگا 6 هستند، تولید میشوند. اکسیداسیون این اسیدهای چرب توسط آنزیمهای سیکلواکسیژناز - COX - یا لیپوکسیژناز - LOX - انجام میشود . - El.Loly
مواد و روش ها
نمونه برداری و استخراج DNA
پس از انتخاب افراد به صورت تصادفی، خونگیری حیوانات با استفاده از ورید دمی با استفاده از ونوجکت حاوی EDTA انجام شد. سپس نمونه ها در مخزن حاوی یخ جمع آوری شده و به آزمایشگاه ژنتیک گروه علوم دامی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری، منتقل و تا زمان استخراج DNA، در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. استخراج DNA نیز طبق دستوالعمل کیت شرکت یکتا تجهیز آزما انجام و نمونه ها پس از شماره گذاری در فریزر -20 درجه نگهداری شدند.
طراحی آغازگرهای اختصاصی
در این تحقیق به منظور تکثیر قطعه ی 362 جفت بازی در ناحیه ی 3"UTR ژن PTGS2 از آغازگر طراحی شده با نرم افزار الیگو استفاده گردید.
واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR -
واکنش زنجیره ای پلیمراز شامل 1 میکرولیتر DNA الگو، 1میکرولیتر آغازگر رفت، 1میکرولیتر آغازگر برگشت، 10 میکرولیتر مستر میکس - حاوی آنزیم DNA پلیمراز، dNTP ها و بافر پی سی آر - و 7 میکرو لیتر آب دیونیزه در حجم کلی 20 میکرولیتر انجام شد. تکثیر قطعه ی مورد نظر، با استفاده از یک مرحله ی ابتدایی واسرشته سازی در دمای 95 œCبه مدت 5 دقیقه و 35 چرخه شامل واسرشته سازی در دمای 95 œC به مدت 30 ثانیه، دمای اتصال آغازگر 54œC به مدت 45 ثانیه و دمای تکثیر 72œCبه مدت 30ثانیه و یک دمای تکثیر نهایی 72œCبه مدت 10دقیقه با استفاده از دستگاه ترموسایکلر - Techne TC-3000G و - Corbett انجام گردید.
الکتروفورز محصولات PCR روز ژل آگارز
محصولات PCR برای جایگاه های مورد نظر روی ژل آگارز % 1 الکتروفورز شدند. مقدار 5 میکرولیتر محصول PCR با 2میکرولیتر بافر بارگذاری به خوبی مخلوط شده و در چاهک ها ریخته شد. برای اطمینان از تکثیر قطعه ی مورد نظر، مقدار 1,4 میکرولیتر شاخص تعیین اندازه ی مولکولی محصول شرکت یکتا جهیز آزما در چاهک میانی ژل بارگذاری شد. الکتروفورز محصولات PCR به مدت 45 دقیقه با ولتاژ 85 ولت انجام شد. پس از الکتروفورز ژل به مدت 5 دقبقه برای رنگ آمیزی در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده شد. در نهایت برای مشاهده ی باندها، از دستگاه مستندسازی ژل استفاده شد.
تعیین ژنوتیپ محصولات PCR ژن مورد نظر روی ژل پلی آکریل آمید - SSCP -
برای مشاهده قطعات حاصل از PCR ژن های مورد مطالعه، از ژل پلی آکریل آمید 10 % استفاده شد. 4 میکرولیتر از محصول PCR با 8 میکرولیتر از بافر بارگذاری مخلوط وبه مدت 10 دقیقه داخل دستگاه PCR با دمای 90 درجه سانتی گراد قرار داده تا DNA تک رشته ای شود. سپس نمونه ها به سرعت به داخل یخچال منتقل شدند تا از به هم چسبیدن دوباره ی رشته های مکمل ممانعت به عمل آید . - Genxi et al. 2012 - به منظور مشاهده ی ژنوتیپ ها از دستگاه الکروفورز عمودی مدل VSTA-1002A استفاده شد. محصولات PCR تک رشته ای به مدت 19 ساعت با ولتاژ 300 ولت روی ژل آکریل آمید 10% الکتروفورز و به وسیله ی نیترات نقره رنگ آمیزی شدند - . - Benbouza. et al. 2006
نتایج
کیفیت نمونه ها ی DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز یک درصد تعیین شد که حاکی از کیفیت بسیار خوب نمونه ها بود. پس از تعیین کیفیت نمونه های DNA، به منظور تکثیر قطعه ی 362 جفت بازی ناحیه ی 3"UTR ژن PTGS2 واکنش زنجیره ای پلی مراز - - PCR به کار گرفته شد. کیفیتت و اندازه ی محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز1 درصد تعیین شدند و همانطور که در تصویر 1دیده می شود قطعه ی مورد نظر به خوبی تکثیر گردیده است.
