بخشی از مقاله
چکیده
ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی - PLRV - ویروسی مهم در مزارع سیب زمینی است که باعث کاهش عملکرد و کیفیت غده هاي سیب زمینی می گردد. تکنیک هاي زیادي جهت تشخیص این ویروس وجود دارند اما هر کدام داراي معایب و مزایاي خاص خود هستند. روش LAMP روش جدیدي جهت تشخیص پاتوژن ها می باشد. تاکنون از این روش جهت تشخیص این ویروس استفاده نشده است و در این پژوهش ما از واکنش RT-LAMP یک مرحله اي که ترکیبی از روش LAMP و نسخه برداري معکوس است، جهت تشخیص این ویروس استفاده نمودیم. ابتدا نمونه ها از سطح شهر زنجان جمع آوري و تست سرولوژیکی انجام شد.
سپس بعد از اینکه نمونه هاي آلوده به ویروس شناسایی شدند، RNA کل استخراج و واکنش RT-LAMP صورت گرفت و واکنش مثبت با دیدن کدورت حاصله و بردن محصول بروي ژل آگارز مشاهده گردید. از مزایاي این روش جدید در مقایسه با سایر روش هاي قبلی می توان به سرعت 75 - دقیقه - ، سهولت، سلامتی، و حساسیت بالاي آن اشاره نمود.
مقدمه
ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی 1 - PLRV - از خانواده Luteoviridae و جنس Polerovirus می باشد . - 3 - اعضاي این خانواده طیف وسیعی از گیاهان دو لپه و تک لپه را آلوده می کنند کهاغلب منحصراًدر بافت آبکشی تکثیر می شوند . استفاده از تکنیک هاي مولکولی در سال هاي اخیر جهت تشخیص پاتوژن هاي گیاهی افزایش یافته است
تکثیر هم دماي وایسته به حلقه 2 - LAMP - یک تکنیک تشخیصی جدید است که به عنوان گزینه اي ارزان و بدون کاهش حساسیت و سرعت تکثیر DNA، توسط نوتومی و همکاران3 در سال 2000 پیشنهاد شد
این روش یک DNA پلیمراز و مجموعه اي از 4 پرایمر اختصاصی، که 6 توالی مشخص از DNA هدف را شناسایی می کنند، به کار می گیرد. اگر ژنوم مورد نظر RNA باشد در این صورت واکنش RT-LAMP که ترکیبی از نسخه برداري معکوس و LAMP است به کار گرفته می شود. روش LAMP سه ویژگی مهم دارداولاً: تمام واکنش ها می تواند تحت شرایط هم دما انجام شود و در مقایسه با PCR معمولی و real-time PCR تجهیزات گران قیمت نیاز نیست.
ثانیاً کارایی و حساسیت تکثیر به میزان زیادي بالا استثالثاً.ی نا واکنش به میزان زیادي اختصاصی است. در خلال 10 سال گذشته، روش LAMP به علت سادگی، سرعت، کارایی بالا و اختصاصیت ممتازش، به طور گسترده اي در آنالیز اسید هاي نوکلئیک به کار گرفته شده است . - 1 - در این تحقیق ما روش RT-LAMP یک مرحله اي4 را که شامل انجام واکنش نسخه برداري معکوس و واکنش LAMP به طور همزمان و در یک تیوب است را براي تشخیص این ویروس براي اولین بار در دنیا به کار بردیم.
مواد و روش ها
در ابتدا از سطح مزارع آلوده اطراف شهر زنجان، نمونه برداري بر اساس علایم ظاهري مانند پیچیدگی و کوتاه قدي گیاهان انجام شد. تست سرولوژیکی با آنتی سرم چند همسانه اي PLRV تهیه شده از مؤسسه DSMZ آلمان بر پایه روش 5 DAS-ELISA و بر اساس روش کلارك و آدامس - 1977 - 6 انجام شد . - 4 - در ابتدا یک دهم گرم بافت برگ در هاون چینی با یک میلی لیتر بافر عصارهگیري، عصارهگیري شد. عصاره حاصل تا زمان ریختن در چاهکهاي پلیت در یخچال نگهداري شد. ابتدا - IgG - مورد نظر به نسبت توصیه شده توسط کمپانی سازنده - 1/1000 - در بافر پوششی رقیق و 100μl آن در چاهکهاي پلیت ریخته شد.
پلیت به مدت 2 الی 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد نگهداري شد. پس از گذشت زمان لازم پلیت تخلیه و سه بار، هر بار به مدت 3 دقیقه با بافر شستشو، شسته شد. سپس پلیت به طور کامل خشک شد و 100μl از نمونههاي گیاهی از قبل آماده شده شامل نمونههاي آلوده، شاهد مثبت، شاهد منفی و بافر عصاره گیري در چاهکها ریخته شد. پلیت موردنظر به مدت یک شب در 4 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
روز بعد پلیت به روش ذکر شده در قبل شسته و این بار پس از خشک کردن کامل پلیت، 100μl از آنتی بادي چندهمسانه اي متصل شده به آنزیم آلکالین فسفاتاز رقیق شده در بافر کانجوگیت7 به چاهکها اضافه و پس از آن پلیت به مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار داده شد. پس از شستشو و خشک کردن پلیت همانند قبل 6/5 mg پارانیتروفنیل فسفات را که سوبستراي آنزیم آلکالین فسفاتاز است در 6/5ml بافر سوبسترا حل کرده و 100μl از آن به هر چاهک اضافه شد. براي مشاهده تغییر رنگ پلیت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از گذشت 30 الی 45 دقیقه تغییر رنگ چاهک به وسیله چشم غیر مسلح دیده شد. از بین این تعداد نمونه 2 نمونه مثبت با نام هاي PLRV10 و PLRV16 شناسایی شدند.
استخراج RNA با استفاده از روش شرح داده شده توسط همتی و همکاران صورت گرفت . - 4 - مرحله بعد انجام واکنش RT-LAMP یک مرحله اي بود. در این واکنش تهیه cDNA از RNA و انجام واکنش RT-LAMP به طور همزمان و به صورت یک مرحله اي در یک تیوب انجام می شود.
آغازگرهاي مورد استفاده با استفاده از برنامه PrimerExplorer V.4 براي ژن کد کننده پوشش پروتئین طراحی شد. جهت انجام واکنش در ابتدا حجم نهایی RNA 5μl - 25μl، 10mM dNTP 1μl، 1μl 10mM DDT، RNasin 0/5μl، 2μl آغازگر 20pmol FIP، 2μl آغازگر 20pmol BIP، 1μl آغازگر 20pmol LF، 1μl آغازگر 20pmol LB، 0/5μl آغازگر 5pmol F3، 0/5μl آغازگر 5pmol B3، 2μl بتائین 10mM، MgSO4 1μl، 2/5μl بافر 10X Bst، 4μl آب استریل - در دماي 72˚C به مدت 3 دقیقه قرار گرفت و بعد از این مدت 0/5μl آنزیم M-Mulv RT و 0/5μl آنزیم DNA Bst پلیمراز اضافه گردید و واکنش در دماي 45˚C به مدت 45 دقیقه، 60˚C به مدت 30 دقیقه و 80˚C به مدت 2 دقیقه ادامه یافت - تمام دماها یک سیکلی بودند - . به محض اتمام واکنش تیوب ها خارج گشت و کدورت حاصل از واکنش مثبت مشاهده گردید.
همچنین محصول حاصل به همراه یک مارکر نردبانی - Gene Ruler, TM 100bp DNA Ladder - در ژل آگارز یک درصد الکتروفورز و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید با دستگاه ژل داك عکسبرداري شد.
نتایج و بحث
هر چند که روش LAMPکارآمدي خود جهت تشخیص ویروس ها را قبلاً نشان داده بود اما تا کنون از این روش جهت تشخیص این ویروس استفاده نشده و ما براي اولین بار، این روش جدیدي را جهت تشخیص ویروس PLRV به کار گرفتیم. جهت تشخیص ویروسPLRV در ابتدا بر روي نمونه هاي جمع آوري شده تست الایزا انجام و بعد از آن دو نمونه مثبت شناسایی شد
شکل-1 نتایج آزمون الایزا. 5F وB10 کنترل مثبت- B5,C5وB10,C7,G10 - PLRV10 B11 وPLRV16 D7
آغازگرهاي مورد استفاده در این آزمایش براي ژن پوشش پروتئین - CP - طراحی شدند
