بخشی از مقاله
چکیده - هدف مطالعه حاضر جداسازي ، کلونینگ و تکثیر قطعه اي از ژن کد کننده پروتیین M1 آنفلوانزا تیپ A می باشد. پروتیین M1 از پروتیین هاي محافظت شده ویروسهاي آنفلوانزا می باشد. پس از تکثیر ویروس آنفلوانزا در تخم مرغ جنین دار، RNA استخراج و با استفاده از روش RT-PCR توالی مورد نظر ژن M1 تکثیر گردید. توالی تکثیر شده خالص سازي و در پلازمید ptz57R/T کلون گردید. محصول کلون شده در باکتري E-coli - xl1-blue - تکثیر و خالص سازي شد. نتایج تحقیق نشان داد باکتري E-coli - xl1-blue - و سیستم پلازمیدي ptz57R/T می توانند جهت کلونینگ و تکثیر موفقیت آمیز ژن هاي ویروس آنفلوانزا مورد استفاده قرار گیرند.
-1مقدمه
بیماري آنفلوانزا یک بیماري ویروسی مسري با انتشار جهانی می باشد. - Alexander, 2007b, Alexander, - 1,2 - - 2007 ویروس هاي آنفلوانزا از خانواده پارامیسکو ویریده می باشند . بر اساس پروتیینهاي نوکلئوپروتیین - NP - و همچنین ماتریکس پروتیین - M1 - 1 به سه جنس A، B و C تقسیم بندي می شوند. جنس A اغلب پستانداران و پرندگان را مبتلا می سازد. جنس B در انسان و جنس C در انسان و خوك بیماري ایجاد می کند. ویروسهاي آنفلوانزا را بر اساس پروتیین هاي سطحی هماگلوتینین و نورآمینیداز و همچنین آزمایش هاي ممانعت از هماگلوتیناسیون و ممانعت از عمل نورآمینیداز به تحت تیپ هایی تقسیم میکنند. تا به امروز 16 نوع پروتیین هماگلوتینین و 9 نوع پروتیین نورآمینیداز شناسایی شده است. . - 4 - - Capua & Alexander, 2008 -
ویروس هاي آنفلوانزا، پروتیین هاي مختلفی دارند از جمله پروتیین هماگلوتینین - HA - ، نورآمینیداز - NA - ، نوکلئوپروتیین - NP - ، پروتیین هاي ماتریکس 1 و 2 M1 - و - M2 و همچنین پروتیینهاي غیر ساختاري 1 و 2 - 8 - . - van den Berg et al., 2008 - . - NS2 , NS1 - پروتیین هایی مانند هماگلوتینین و نورآمینیداز به علت جهش هایی که در ژنهاي کد کننده این پروتیین ها ایجاد می گردد به طور مداوم در حال تغییر می باشند ولی برخی دیگر از پروتیین ها مانند پروتیین هاي ماتریکس در بین اغلب جدایه هاي ویروسهاي آنفلوانزا ثابت و بدون تغییر می باشند و به علت ماهیت عدم تغییر در این پروتیین ها ، از آن ها در اغلب آزمایشات تشخیصی و مولکولی استفاده می گردد.
ویروس هاي آنفلوانزا، می توانند به سرعت در بین میزبان هاي خود منتشر گردند. لذا به منظور پیشگیري وکنترل موفق این بیماري، تشخیص سریع و زود هنگام آن در بین یک جمعیت از اهمیت بالایی برخوردار می باشد. هدف از تحقیق حاضر، جدا سازي، کلونینگ و تکثیر قطعه اي از ژن کد کننده پروتیین M1 ویروس آنفلوانزاي تیپ A می باشد. با توجه به ماهیت محافظت شده این پروتیین در بین ویروس هاي آنفلوانزاي A از محصول تکثیر شده ژن می توان جهت انجام تحقیقات آزمایشگاهی و همچنین طراحی تستهاي تشخیصی استفاده نمود. - Bui et al., - 3,9 - . - 2000, Ye et al., 1987
-2 مواد و روش ها
-2-1 تهیه ویروس آنفلوانزا
ویروس آنفلوانزاي ماکیان تحت تیپ H9N2 با مشخصه A/chicken/Iran/772/1988 - H9N2 - انتخاب و در تخم مرغ جنین دار 9 روزه تکثیر گردید. براي این منظور 0/2 میلی لیتر ویروس به داخل حفره آلانتوئیک تخم مرغ تلقیح شد و پس از نگهداري تخم مرغ ها در دماي 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت ، تخم مرغ ها از دستگاه انکوباتور خارج و پس از سرد کردن، مایع آلانتوئیک آن ها برداشت و با استفاده از روش رید و مانش EID50 آن ها محاسبه گردید. - Reed & Muench, . - 7 - - 1938 مایع آلانتوئیک برداشت شده حاوي 107/5 EID50 ویروس در هر میلی لیتر بود.
-2-2 استخراج RNA ویروس از مایع
آلانتوئیک
جهت استخراج RNA از مایع آلانتوئیک از کیت استخراج RNA ویروس QIAamp® Viral RNA Kit - کیاژن - استفاده گردید. 140 میکرولیتر از مایع آلانتوئیک به 560 میکرولیتر بافر حاوي Carrier RNA اضافه و به مدت 15 ثانیه مخلوط شد. با استفاده از دستورالعمل شرکت سازنده کیت و انجام مراحل ذکر شده در کیت، RNA ویروس استخراج و در تیوپ هاي 1/5 سی سی تا زمان استفاده در فریزر -œ70C نگهداري گردید.
-2-3 واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR -
-2-3-1 سنتز cDNA
به منظور سنتز cDNA از کیت AccuPowder®RT PreMix - Bioneer - استفاده گردید. توالی پرایمرها در جدول 1 آورده شده است. براي انجام این واکنش 1ʽl راندم هگزامر، 1ʽl پرایمر با غلظت 20pmol، 10ʽl RNA و ʽ12l آب مقطر حاوي DEPC مخلوط و به مدت 5 دقیقه در دماي œ70C انکوبه گردید.
-2-4 تخلیص محصول PCR
جهت خالص سازي آمپلیکونهاي به دست آمده، محصول PCR در آگارز زود ذوب 0/8 - LMA - درصد محتوي اتیدیوم بروماید الکتروفوز گردید. و در مقابل نور UV محدوده باند DNA مشخص گردید. قطعات ژل به لوله هاي ʽ5/1l منتقل و وزن آنها محاسبه گردید. با استفاده از کیت خالص سازي DNA به نام - Bioneer - Accupowder®Gel purificatian، تخلیص DNA انجام شد. با روش اسپکتروفتومتري، OD محصول PCR در طول موج 260 نانومتر در رقت محاسبه و میزان DNA در هر سی سی به دست آمد.
-2-5 تهیه پلازمید نو ترکیب
براي تهیه پلازمید نوترکیب از سیستم حامل ptz57R/T - Fermentase - استفاده شد.
