بخشی از مقاله
چکیده
ویروس بیماری اسهال ویروسی گاوان - BVDV - یکی از ویروس های خانواده Flaviviridae جنس Pestivirus است. ژنوم ویروس، از یک RNA تک رشته ای با پلاریته مثبت که تقریبا 12/3 kb می باشد، تشکیل شده است. بر اساس اختلافات آنتیژنی و ژنتیکی، ویروس BVDV به دو ژنوتیپ 1 و 2 تقسیم میشود که از یکدیگر و از سایر پستی ویروسها توسط آنتیبادیهای منوکلونال - MAb - ایجاد شده بر ضد پروتئین E2، یا بهوسیله آنالیز نواحی مختلف ژنوم، مجزا میشوند.
در مطالعه حاضر از حداقل 400 رأس گوساله و گاو متعلق به تعدادی از گاوداریهای استان فارس طی دو مرحله خونگیری به عمل آمد. نمونههای خون به درون لولههای حاوی ماده ضد انعقاد ریخته شد. نمونهها بهسرعت به آزمایشگاه ویروسشناسی دانشکده دامپزشکی شیراز منتقل و جهت انجام آزمایشهای PCR سانتریفیوژ شدند. بافیکوت جداسازی شده تا زمان انجام مراحل بعدی در فریزر -70 درجه سانتیگراد نگهداری شد. در مرحله بعد از گوساله و گاوهای تشخیص داده در مرحله اول یا گوسالههای متعلق به دامداریهای با سابقه آلودگی خون گیری به عمل آمد. RNA استخراج شده تا زمان استفاده به فریزر -70 درجه سانتیگراد منتقل گردید.
جهت غربالگری اولیه و یافتن نمونههای آلوده به پستی ویروسها، واکنش زنجیرهای پلیمراز بر روی نمونههای مخلوط انجام پذیرفت. پس از شناسایی نمونههای مخلوط مثبت مجدداً آزمایش بر روی نمونهها بهصورت تکی انجام شد و نمونههای مثبت شناسایی شد. سپس آزمایش nested PCR بر روی نمونههای مثبت بهصورت تکی انجام شد. جهت تشخیص نمونههای PI، هر نمونه که در این مرحله مثبت میبود مجدداً آزمایش nested PCR بر روی بافیکوت جدا شده از نمونههای خون مرحله دوم انجام گرفت.
نتایج حاصل از آزمایش مولکولی با استفاده از زوج پرایمرهای 324 و 326 که جهت تعیین پستی ویروس در نمونههای Pool انجام شد مؤید مثبت بودن 5گروه - 20تایی - از مجموع نمونههای Pool بود. با توجه به نتایج RT-PCR و تعیین توالی محصولات، 6 مورد ژنوتیپ BVDV-1 و 2 مورد ژنوتیپ BVDV-2 شناسایی شد و دو نمونه متعلق به سویهی NADL بودند.
مقدمه
ویروس بیماری اسهال ویروسی گاوان - BVDV - به ویروس هایی اطلاق می شود که در خانواده Flaviviridae جنس Pestivirus طبقه بندی می شوند. ژنوم ویروس، از یک RNA تک رشته ای با پلاریته مثبت که تقریبا 12/3 kb می باشد، تشکیل شده است.
بر اساس اختلافات آنتیژنی و ژنتیکی، ویروس BVDV به دو ژنوتیپ 1 و 2 تقسیم میشود که از یکدیگر و از سایر پستی ویروسها توسط آنتیبادیهای منوکلونال - MAb - ایجادشده بر ضد پروتئین E2، یا بهوسیله آنالیز نواحی مختلف ژنوم، مجزا میشوند. ترکیب این دو تیپ ویروس اسهال ویروسی گاوها و واکنش آنها با میزبان محققان را دچار مشکل کرده است. درحالیکه BVDV-1 ژنوتیپ غالب در سرتاسر دنیا است، به نظر میرسد که BVDV-2 در آمریکا و کانادا اهمیت بیشتری دارد.
در اروپا، آسیا و آمریکای جنوبی BVDV-2 بهصورت تکگیر گزارششده است. بهوسیله مطالعات مولکولی BVDV-1 و BVDV-2 حداقل به 11 زیرگروه برای BVDV-1 و 2 زیرگروه برای BVDV-2 تقسیمبندی میشوند. ژنوتیپهای BVDV-2 ازنظر آنتیژنی باهم تفاوت دارند و بعضی از سویههای آن، همهگیریهای شدیدی را باعث میشوند. تمامی سویههای جداشده BVDV-2 توانایی ایجاد بیماری بالینی شدید را ندارند و سویههای غیر بیماریزا نیز در بین آنها وجود دارد.
تلقیح سویههای بیماریزا متعلق به ژنوتیپ BVDV-2 به گوسالهها عوارضی ایجاد میکنند که با علائمی چون تب، اسهال، لوکوپنی، لنفوپنی، نوتروپنی، ترومبوسیتوپنی و مرگ همراه است. عفونتهای ایجادشده با سویههای غیر بیماریزای BVDV-2 باعث لوکوپنی و تب خفیف میشوند. اخیراً، یک تیپ غیرمعمول به نام HoBi نیز شناساییشده است که آن را بهعنوان سومین ژنوتیپ BVDV پیشنهاد کردهاند.
حقیقت نگرانکننده اینکه تعداد فزایندهای از سویههای جداشدهی گزارش گردیده از آزمایشگاههای تشخیص، نوع 2 است. نوع 2 ویروس BVD متداولترین گروه ویروسی جداشده از سندرم هموراژیک، BVD حاد و فوق حاد و گوسالههای دچار عفونت پایدار - PI - از مادران واکسینه علیه BVD است. تنوع پادگنی در سویههای جداشده گزارششده است این تنوع بین ویروسهای جداشدهی BVD که در آزمایش خنثیسازی واکنش ندارند نشاندهندهی تنوع پادگنی است که ممکن است در شکست مایهکوبی مؤثر باشد.
تجزیه ی ژنتیکی سویههای نوع 1و 2 ویروس BVD در مقایسه با ویروس وبای خوک نشان داده است که سویه نوع 2 ویروس BVD به اندازهی ویروس وبای خوک از سویه نوع 1 ویروس BVD متفاوت است. تنوع ژنتیکی و تنوع پادگنی مشاهدهشده است در سویههای جداشدهی ویروس BVD از جهشهای مداوم ویروس ناشی میشود. تحت تیپها و سویههای BVDV مستعد جهش و نوترکیبی هستند و این تغییرات موجب ظهور واریانتهای آنتیژنی میشوند. در هر دو گروه BVDV-1 و BVDV-2 سویههای سایتوپاتیک و غیر سایتوپاتیک یافت میشود.
مواد و روش کار
از حداقل 400 رأس گوساله و گاو متعلق به تعدادی از گاوداریهای استان فارس طی دو مرحله خونگیری به عمل آمد. نمونههای خون به درون لولههای حاوی ماده ضد انعقاد ریخته شد. نمونهها بهسرعت به آزمایشگاه ویروسشناسی دانشکده دامپزشکی شیراز منتقل گردید. نمونهها جهت انجام آزمایشهای PCR سانتریفیوژ شد. بافیکوت جداسازی شده تا زمان انجام مراحل بعدی در فریزر -70 درجه سانتیگراد نگهداری شد. در مرحله بعد از گوساله و گاوهای تشخیص داده در مرحله اول یا گوسالههای متعلق به دامداریهای با سابقه آلودگی خون گیری به عمل آمد.
استخراج RNA از بافیکوت
جهت استخراج RNA از نمونههای بافیکوت از کیت استخراج Cinnapure RNA, RNA ساخت شرکت سیناژن استفاده گردید. RNA استخراج شده تا زمان استفاده به فریزر -70 درجه سانتیگراد منتقل گردید.
پرایمرهای مورد استفاده
جهت غربالگری اولیه و یافتن نمونههای آلوده به پستی ویروسها، با استفاده از زوج آغازگرهای 324 و 326 واکنش زنجیرهای پلیمراز بر روی نمونههای مخلوط انجام پذیرفت. پس از شناسایی نمونههای مخلوط مثبت مجدداً آزمایش بر روی نمونهها بهصورت تکی انجام شد و نمونههای مثبت شناسایی شد. سپس آزمایش nested PCR بر روی نمونههای مثبت بهصورت تکی با استفاده از زوج آغازگرهای OI 100 و 1400R و همچنین BD1 و BD2 انجام شد. جهت تشخیص نمونههای PI، هر نمونه که در این مرحله مثبت میبود مجدداً آزمایش PCR nested بر روی بافیکوت جداشده از نمونههای خون مرحله دوم انجام گرفت. جهت تشخیص سویههای ویروس - سویههای NADL و - UK، آزمایش PCR با استفاده از زوج آغازگرهای BD1 و BD3 و همچنین BD1 و BD4 انجام پذیرفت.
