مقاله طراحی SiRNA جهت ایجاد مقاومت نسبت به ویروس موزائیک یونجه Alfalfa mosaic virus

بخشی از مقاله

چکیده

استفاده از - Small hairpin RNA - siRNA روشی قدرتمند براي خاموش کردن ژن هاي هدف می باشد. SiRNA ها این توانایی را دارند که براي خاموش کردن اختصاصی ژن هاي ویروس Alfalfa mosaic virus در گیاهان میزبان از جمله یونجه - - Medicago sativa مورد استفاده قرار گیرند و در نتیجه این گیاهان نسبت به ویروس مربوطه مقاومت پیدا کنند. چالشی که در اینجا وجود دارد طراحی SiRNA هاي است که بتوانند بدون در نظر گرفتن تنوع ژنتیکی در ایزوله هاي مختلف ویروس مورد نظر باعث خاموش شدن ژنهاي ویروس شوند و همچنین این SiRNA باید به گونه اي طراحی شوند که ژن هاي گیاه را خاموش نکنند.

در این مطالعهSiRNA بر اساس مناطق بسیار حفظ شده ژن کد کننده پروتئین پوششی ویروس از جدایه هاي مختلف ویروس - Alfalfa mosaic virus - AMV که آلوده کننده خیار می باشد، طراحی شد. براي طراحی SiRNA با شرایط مذکور از نرم افزارهاي طراحی کننده SiRNA استفاده شد. در نهایت جستجوي متقابل در ژنوم گیاه یونجه با استفاده از ابزار BLASTتایید کرد که siRNA هاي طراحی شده هیچ مشابهتی در ژنوم گیاه ندارند. بدین منظور siRNAهاي مورد نظر براي ژن کد کننده پروتئین پوششی طراحی گردید که می توانند در روش هاي مبارزه با این ویروس مورد توجه قرار گیرند.

مقدمه

استفاده از روش هاي سنتی اصلاح نباتات در بهبود کمیت و کیفیت محصولات کشاورزي مفید بوده است اما این روش ها به دلیل در دسترس نبودن منابع ژنتیک مطلوب، وقت گیر بودن و غیره داراي محدودیت هاي زیادي می باشند. یکی از روش هاي جدیدي که براي بهبود کیفیت محصولات کشاورزي و مبارزه با پاتوژن هاي گیاهی استفاده می شود استفاده از siRNA ها براي خاموش کردن ژن هاي هدف در پاتوژن هاي خاص گیاهی می باشدRNA . - Tang et al 2004هاي دورشته ي با برش توسط پروتئین دایسر به siRNA تبدیل می شوند - Salari et al.,2011 - که در ادامه این RNA هاي دو رشته ي کوتاه تحت تاثیر فرایندهاي دیگر باعث خاموش شدن ژن هاي هدف می شوند

ویروس موزائیک یونجه از مهمترین ویروس هاي یونجه محسوب می شود که سالیانه باعث خسارت زیادي به این محصول در کشورهاي مختلف جهان می شود - . - masoomi et al.,2000 یکی از ژن هاي اساسی در ژنوم این ویروس پروتئین پوششی می باشد. با توجه به اهمیت یونجه از نظر اقتصادي استفاده از روش هاي جدید براي جلوگیري از بیمارگري این ویروس قابل توجه می باشد. روش هاي موجود براي مقابله با این ویروس شامل روش هاي فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و تراریخته کردن می باشد که این روش ها هر کدام معایب و مزایاي خاص خود را دارند . مهندسی ژنتیک و استفاده از siRNA داراي مزایاي زیادي نسبت به روش هاي قبلی براي ایجاد مقاومت در گیاهان می باشد. هدف از این تحقیق طراحی siRNA مناسب جهت مقاومت یونجه نسبت به ویروس موزائیک یونجه می باشد.

استفاده از ترانسکریپت هاي آر.ان.اي در گیاهان ترانس ژنیک باعث یک کشف بزرگ در زمینه زیست شناسی ملکولی گردید. مکانیزمی که بطور اختصاصی باعث خرد شدن آر.ان.اي می گردد. این پدیده همان خاموش سازي ژن بعد از نسخه برداري - post-transcriptional gene silencing, PTGS - و یا تداخل آر.ان.اي - RNA interference, RNAi - است که در گیاهان و سایر یوکاریوت ها وجود دارد. پدیده خاموش سازي ژن، مکانیزمی است که یک ترادف آر.ان.اي - و نه mRNA، tRNA و یا - rRNA تنظیم بیان ژن را کنترل کند. تنظیم بیان ژن یا با کاهش نسخه برداري mRNA و /یا با کاهش محصول نهائی ژن خاصی صورت می گیرد.

در این مکانیزم در گیاه ترانس ژن، آر.ان.اي هائی که داراي ترادف اختصاصی و مشابه با آر.ان.اي موجود در گیاه ترانس ژن می باشند، خرد شده و باعث ایجاد مقاومت در گیاه می گردد. مکانیزم تشخیص ترادف اختصاصی بر اساس تولید مولکول هاي کوچک آر.ان. اي مداخله گر - small interfering RNA, siRNA - است که در گیاه ترانس ژن تولید می شوند. بعدا با مشاهده وجود مولکول هاي RNAi در گیاهان غیر ترانس ژن، مشخص گردید که این پدیده بعنوان یک مکانیزم دفاعی ضد ویروسی، از قبل در گیاهان وجود دارد. ولی در گیاهان غیر ترانس ژن، پروتئین هائی ساخته می شوند که اثر بازدارنده روي پدیده خاموش سازي ژن را دارند.

در این گیاهان، بدلیل اینکه به لحاظ زمانی فاصله اي بین آلودگی و القاء پدیده خاموش سازي ژن وجود دارد ویروس قادر به تولید پروتئین هاي باز دارنده است. بدست آمدن اطلاعات بیشتري در رابطه با مکانیزم خاموش سازي ژن، منجر به ساخت ترادف هاي تکراري معکوس - inverted repeated, IR - از قطعات بلند dsRNA گردید که پیش ساز RNAi محسوب می شوند.

کاربرد سازه هاي IR در مقایسه با سازه هاي تک رشته اي - سنس یا آنتی سنس - باعث افزایش راندمان مقاومت در گیاهان ترانس ژن گردید. در حالیکه 5-%20 گیاهان ترانس ژن حاوي سازه هاي تک رشته اي - سنس یا آنتی سنس - مقاوم بودند، این رقم در گیاهان حاوي سازه هاي IR نزدیک به %90 بود. تصور بر این است علت این امر وارد شدن دائمی dsRNAs به مرحله بعدي مسیر خاموش سازي است. در این مرحله dsRNA بعنوان سوبسترا براي یک آنزیم از گروه آنزیم هاي RNase III بنام دایسر - Dicer - عمل می کند. با استفاده از سازه هاي IR، امکان تولید گیاهان مقاوم در مقابل بسیاري از ویروس هاي آر.ان.اي گیاهی فراهم شده است.

قطعات تولید شده siRNA در گیاه ترانس ژن، خود بخشی از - RNA-inducing complex, RISC - می باشند که قبل از آلودگی قادر به تشخیص ترادف هاي اختصاصی مشابه می باشد. یکی از اشکالات استفاده از مقاومت با استفاده از آر.ان.اي ویروس - RNA-mediated resistance - این است که این روش بر علیه ویروس هائی که ترادف آن ها بیش از % 10 با ترادف ویروسی موجود در گیاه ترانس ژن متفاوت باشد موثر نیست. بعضی از محققین به منظور ایجاد مقاومت با طیفی وسیع تر، ترادف 150 نوکلئوتیدي چهار توسپوویروس - tospovirus - را با یکدیگر تلفیق کرده و یک سازه IR کوچک و شیمر - chimer - را تولید کرده اند که بر علیه چهار ویروس ها مقاوم است. علاوه بر پدیده خاموش سازي ژن بعد از نسخه برداري - PTGS - ، پدیده دیگري بنام خاموش سازي ژن قبل از نسخه برداري - transcriptional gene silencing, TGS - نیز وجود دارد که در ابتدا از نسخه برداري ژن جلوگیري می کند. این کار با اضافه شدن گروه متیل - methylation - به ترادف خاصی از دي.ان.اي مثل پروموتور صورت می گیرد و منجر به توقف دائم نسخه برداري می شود.

مواد و روش ها

شناسایی و بازیابی توالی هاي ژن هاي پروتئین پوششی از ویروس هدف: با استفاده از پایگاه داده هاي ویروس هاي گیاهی به آدرس - - DPV;www.dpwweb.net و سایت NCBI توالی هاي مربوط به ژن مورد نظر در 10 جدایه مختلف ویروس موزائیک زرد یونجه دریافت شد.همردیف سازي توالی ها: همردیفی توالی ها با استفاده از نرم افزار قدرتمند CLC Main workbench5.5 وBLAST انجام شد و150نوکلئوتید از ناحیه حفاظت شده توالی ها جهت طراحی siRNA ها انتخاب گردید.

طراحی siRNA ها: با استفاده از نرم افزارTRC به آدرس www.broadinstitute.org نجام شد و جهت بررسی ساختار سنجاق سري siRNAها از نرم افزار IDT به آدرسhttp://eu.idtdna.com/siteاستفاده شد. آنالیز siRNA هاي طراحی شده: با استفاده ازابزار BLAST جهت بررسی Offtarget انجام شد که تنها مناطق حفظ شده ي از ژن هاي پروتئین پوششی ویروسی براي طراحی siRNA استفاده شد و هیچ تشابهی با ژن هاي یونجه نداشتند و از خاموش شدن ژن هاي یونجه جلوگیري می شود. این کار با استفاده از بلاست نوکلئوتید در سایت NCBI به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih انجام شد.

نتایج و بحث

نتایج به دست آمده از طراحی siRNA بر اساس مناطق حفظ شده ژن کد کننده پروتئین پوششی10 ایزوله مختلف ویروس موزائیک یونجه - شکل - 1 که از نظر فیلوژنتیکی داراي تشابه و تفاوت هاي با یکدیگر بودند - شکل - 2 نشان داد که بر اساس توالی هاي کدکننده ژن پروتئین پوششی در ایزوله هاي این ویروس می توان siRNA مناسب بر علیه ژنوم این ویروس طراحی کرد که در تمامی ایزوله ها کاربرد داشته باشد و هیچ ژنی را از خود گیاه یونجه خاموش نکند

بررسی همردیفی بین توالی هاي پروتئین پوششی در جدایه هاي مختلف نشان داد که این پروتئین تا حد زیادي بین جدایه هاي مختلف ویروس AMV حفظ شده می باشد که این موضوع می تواند نشانگر اهمیت این پروتئین در مطالعات مربوط به این ویروس باشد. 5 توالی siRNA طراحی شد که پس از بررسی ساختار سنجاق سري - - Hairpain آنها مشخص شد که هر کدام داراي شرایط بهینه تولیدsiRNA و خاموش سازي ژن براي این ویروس را می توان براي فعالیت هاي مهندسی ژنتیک در جهت ایجاد مقاومت عمومی در یونجه نسبت به این ویروس مورد استفاده قرار داد.