بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از - Small hairpin RNA - shRNA روشی قدرتمند براي خاموش کردن ژن هاي هدف می باشد. ShRNA ها این توانایی را دارند که براي خاموش کردن اختصاصی ژن هاي ویروس Zucchini yellow mosaic virus در گیاهان میزبان از جمله کدوpepo - - Cucurbita مورد استفاده قرار گیرند و در نتیجه این گیاهان نسبت به ویروس مربوطه مقاومت پیدا کنند. چالشی که در اینجا وجود دارد طراحی ShRNA هاي است که بتوانند بدون در نظر گرفتن تنوع ژنتیکی در ایزوله هاي مختلف ویروس مورد نظر باعث خاموش شدن ژنهاي ویروس شوند و همچنین این ShRNA باید به گونه اي طراحی شوند که ژن هاي گیاه را خاموش نکنند.
در این مطالعهShRNA بر اساس مناطق بسیار حفظ شده ژن کد کننده پروتئین پوششی ویروس از جدایه هاي مختلف ویروس - Zucchini yellow mosaic virus - ZYMV که آلوده کننده خیار می باشد، طراحی شد. براي طراحی ShRNA با شرایط مذکور از نرم افزارهاي طراحی کننده ShRNA شامل TRC و IDT استفاده شد. در نهایت جستجوي متقابل در ژنوم گیاه کدو با استفاده از ابزار BLASTتایید کرد که shRNA هاي طراحی شده هیچ مشابهتی در ژنوم گیاه ندارند. بدین منظور shRNAهاي مورد نظر براي ژن کد کننده پروتئین پوششی اختصاصی عمل می کنند و می تواند کاندید مناسبی جهت ایجاد مقاومت بر پایه RNA باشد.
-1مقدمه:
استفاده از روش هاي سنتی اصلاح نباتات در بهبود کمیت و کیفیت محصولات کشاورزي مفید بوده است اما این روش ها به دلیل در دسترس نبودن منابع ژنتیک مطلوب، وقت گیر بودن و غیره داراي محدودیت هاي زیادي می باشند. یکی از روش هاي جدیدي که براي بهبود کیفیت محصولات کشاورزي و مبارزه با پاتوژن هاي گیاهی استفاده می شود استفاده از shRNA ها براي خاموش کردن ژن هاي هدف در پاتوژن هاي خاص گیاهی می باشد . - Tang et al.,2007 - یک ار.ان.اي سنجاق سري کوچک shRNA توالی از RNA است که از طریق تداخل باعث خاموشی ژن هدف می شود
کدو گیاهی است یکساله و جز گیاهان عالی گلداراز تیره Cucurbitaceae جنس Cucurbita با گونه هاي maximaCucurbita، MoschataCucurbita، Cucurbita pepoمی باشد و ژنوم آن با روش هاي سنتی و روش نسل بعد next generation تعیین توالی شده استو محصول مهم در تغذیه می باشد
ویروس موزائیک زرد کدو از مهمترین ویروس هاي کدو محسوب می شود که سالیانه باعث خسارت زیادي به این محصول در کشورهاي مختلف جهان می شود - . - Fletcher and Wallace 2000 این ویروس یک ویروس رشته اي شکل با ژنوم RNA تک رشته از جنس Potyvirus است که بوسیله شته منتقل می شود . - Abou-Jawadah et al.,2000 - با توجه به اهمیت محصولات خانواده کدوئیان از نظر اقتصادي استفاده از روش هاي جدید براي جلوگیري از بیمارگري این ویروس درکدو قابل توجه می باشد. روش هاي موجود براي مقابله با این ویروس شامل روش هاي فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و تراریخته کردن می باشد که این روش ها هر کدام معایب و مزایاي خاص خود را دارند - . - 2 مهندسی ژنتیک و استفاده از shRNA داراي مزایاي زیادي نسبت به روش هاي قبلی براي ایجاد مقاومت در گیاهان می باشد
هدف از این تحقیق طراحی shRNA مناسب بر علیه ژن پروتئین پوششی این ویروس که یک ژن حفاظت شده در ژنوم آن است - Yakoubi et al.,2008 - در جهت مقاومت محصول نسبت به ویروس موزائیک زرد کدو می باشد.
-2مواد و روشها:
شناسایی و بازیابی توالی هاي ژن هاي پروتئین پوششی از ویروس هدف: با استفاده از پایگاه داده هاي ویروس هاي گیاهی به آدرس - - DPV;www.dpwweb.net و سایت NCBI توالی هاي مربوط به ژن مورد نظر در 10 جدایه مختلف ویروس موزائیک زرد کدو دریافت شد.
همردیف سازي توالی ها: همردیفی توالی ها با استفاده از نرم افزار قدرتمند CLC Main workbench5.5 وBLAST انجام شد و150نوکلئوتید از ناحیه حفاظت شده توالی ها جهت طراحی shRNA ها انتخاب گردید.طراحی shRNA ها: با استفاده از نرم افزارTRC به آدرس www.broadinstitute.org انجام شد و جهت بررسی ساختار سنجاق سري shRNAها از نرم افزار IDT به آدرسhttp://eu.idtdna.com/siteاستفاده شد. آنالیز shRNA هاي طراحی شده: با استفاده ازابزار BLAST جهت بررسی Offtarget انجام شد که تنها مناطق حفظ شده ي از ژن هاي پروتئین پوششی ویروسی براي طراحی shRNA استفاده شد و هیچ تشابهی با ژن هاي کدو نداشتند و از خاموش شدن ژن هاي کدو جلوگیري می شود. این کار با استفاده از بلاست نوکلئوتید در سایت NCBI به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih انجام شد.
-3نتایج:
نتایج به دست آمده از طراحی shRNA بر اساس مناطق حفظ شده ژن کد کننده پروتئین پوششی 10 ایزوله مختلف ویروس موزائیک زرد کدو - شکل - 1 که از نظر فیلوژنتیکی داراي تشابه و تفاوت هاي با یکدیگر بودند - شکل - 2 نشان داد که بر اساس توالی هاي کدکننده ژن پروتئین پوششی در ایزوله هاي این ویروس می توان shRNA مناسب بر علیه ژنوم این ویروس طراحی کرد که در تمامی ایزوله ها کاربرد داشته باشد و هیچ ژنی را از خود گیاه کدو خاموش نکند - جدول. - 1 بررسی همردیفی بین توالی هاي پروتئین پوششی در جدایه هاي مختلف نشان داد که این پروتئین تا حد زیادي بین جدایه هاي مختلف ویروس ZYMV حفظ شده می باشد که این موضوع می تواند نشانگر اهمیت این پروتئین در مطالعات مربوط به این ویروس باشد.
5 توالی shRNA طراحی شد که پس از بررسی ساختار سنجاق سري - - Hairpain آنها مشخص شد که هر کدام داراي شرایط بهینه تولیدshRNA و خاموش سازي ژن براي این ویروس را می توان براي فعالیت هاي مهندسی ژنتیک در جهت ایجاد مقاومت عمومی در کدو نسبت به این ویروس مورد استفاده قرار داد. از آنجا که shRNAهاي طراحی شده هیچ گونه شباهتی در ژنوم گیاه کدو ندارند، می توانند گزینه هاي مناسبی براي آزمایش هاي عملی بیشتر بر روي این گیاه باشند، از طرف دیگر به دلیل حفاظت شدگی بالاي ژن کد کننده پروتئین پوششی بین جدایه هاي مختلف ویروس مورد نظر، می توان امیدوار بود که مقاومت پس از بکارگیري این shRNA ها در گیاه کدو پایدار باشد و تا حد زیادي از خسارت این ویروس به محصول بکاهد.
شکل-1تعیین و انتخاب نواحی حفاظت شده ژن پروتئین پوششی CP در بین ایزوله هاي مختلف ویروس موزائیک زرد کدوZYMV
