بخشی از مقاله
چکیده
سازمان بهداشت جهانی استفاده از واکسنهاي کنژوگه پنوموکک را براي محافظت از کودکان در برابر بیماریهاي پنوموککی توصیه کرده است. آنتی ژن مورد استفاده در ساخت این واکسنها، کپسول پنوموکک است. پنوموکک سروتیپ 19F سروتیپی مهم در بیماریزایی این باکتري است. بنابراین هدف این مطالعه تعیین شرایط مناسب تولید کپسول پنوموکک سروتیپ 19F است.
با توجه به وابستگی تولید محصولات میکروبی به سویه باکتري مورد استفاده و نیز شرایط محیطی کشت، تولید کپسول سروتیپ 19F در سویه هاي پنوموکک پس از کشت در محیط تغییر یافته Hoeprich در دماي 37°C و pH 7.5 با استفاده از روش stains all بررسی شد. انالیز آماري نتایج مذکور با تست توکی صورت گرفت. مقایسه پروفایل پروتئینی سویه ها با استفاده از SDS-PAGE 10% انجام شد.
سویه S. pneumoniae 67H بالاترین میزان تولید کپسول - 0.656-0.01 mg/ml - را در میان ایزوله هاي ایرانی مورد مطالعه داشت. اما میزان کپسول تولیدي سویه 1.6 - 1.053 mg/ml - S. pneumoniae SSI 82218 برابر سویه S. pneumoniae 67H بود. نتایج تست توکی موید اختلاف معنی داردر میزان تولید کپسول این دو سویه بود. بنابراین سویه S. pneumoniae SSI 82218 سویه برتر براي تولید کپسول میباشد. پروفایل پروتئینی دو سویه مذکور از نظر شدت باندهاي مشاهده شده در محدوده 99-100 kDa در ژل SDS-PAGE متفاوت بودند.
محدوده مناسب pH براي تولید کپسول توسط سویه برتر 6.5-7.5 بود. افزایش در دماي کشت سویه برتر تا 37 °C منجر به افزایش در میزان تولید کپسول شد اما کشت در دماي بالاتر منجر به کاهش در تولید کپسول شد. محدوده مناسب همزدگی 0-30 rpm بود و افزایش بیشتر سرعت همزدگی منجر به کاهش قابل توجه در میزان تولید کپسول شد. میزان کپسول تولیدي توسط سویه برتر در این تحقیق بسیار بالاتر از مقادیر گزارش شده توسط محققین دیگر بود بنابراین نتایج ما میتواند در طراحی سیستم مناسب تولید کپسول پنوموکک سروتیپ 19F مورد استفاده قرار گیرد.
.1 مقدمه
استرپتوکوکوس پنومونیا - پنوموکک - پاتوژنی بسیار با اهمیت است که منجر به ایجاد بیماریهایی مانند مننژیت، پنومونیا و سپسیز در انسان میشود .برآوردهاي سازمان بهداشت جهانی نشان میدهند که بیماریهاي ناشی از این باکتري سالیانه عامل مرگ و میر 476000 کودك زیر 5 سال در جهان هستند .[2] استفاده از آنتی بیوتیکها در کنترل این باکتري به علت ظهور سویه هاي مقاوم به آنتی بیوتیک مطلوب نمیباشد
سازمان بهداشت جهانی استفاده از واکسنهاي پنوموکک را در برنامه هاي ایمن سازي کودکان در سراسر جهان توصیه میکند [2] .تاکنون 44% از کشورهاي عضو سازمان بهداشت جهانی 86 - کشور - واکسن پنوموکک را در برنامه ملی واکسیناسیون کودکان وارد کرده اند و کمیته ایمن سازي کشوري ایران نیز در سال 93 ورود واکسن پنوموکک به برنامه جاري ایمن سازي کودکان کشور را تصویب نموده است. استرپتوکوکوس پنومونیا یک باکتري انکپسوله است و کپسول احاطه کننده آن که پلی ساکاریدي با وزن ملکولی بالا است، عامل مقاومت این باکتري در برابر سیستم ایمنی میزبان است
این پلی ساکارید کپسولار، آنتی ژن اصلی مورد استفاده در ساخت واکسن هاي پنوموککی است که پاسخ ایمنی ایجاد شده در اثرآن باعث محافظت از میزبان واکسینه شده در برابر استرپتوکوکوس پنومونیا میشود .[1] استرپتوکوکوس پنومونیاهایی که عامل عمده ایجاد بیماریهاي مرتبط با این باکتري در کودکان در جهان هستند متعلق به تعداد محدودي از سروتیپهاي این باکتري شامل 1، 5، 6A، 6B، 14، 19Fو 23F میباشند .
استرپتوکوکوس پنومونیا مهمترین عامل ایجاد مننژیت باکتریایی در ایران بوده است . [10] در مطالعات انجام شده در ایران بر روي کودکان بیمار مشخص شده است که در 84% موارد سروگروپهاي 6، 19، 14و 5 در ایجاد بیماري دخیل بوده اند. بعلاوه سروتیپ 19F از جمله سروتیپ هاي غالب در ایزوله هاي حلقی کودکان بوده است .بنابراین با توجه به اهمیت پنوموکک سروتیپ 19F در بیماریزایی این باکتري و نیز وابستگی تولید فرآورده هاي میکروبی به وضعیت کشت شامل سویه مورد استفاده و شرایط محیطی کشت
هدف این پروژه تعیین سویه مناسب تولید کپسول پنوموکک سروتیپ 19F و نیز محدوده مناسب شرایط محیطی کشت آن است تا به این ترتیب زمینه اي براي تولید این محصول و استفاده آتی از آن در ساخت واکسن بر ضد استرپتوکوکوس پنومونیا در کشور فراهم گردد.
.2 مواد و روشها
سویه هاي پنوموکک مورد استفاده در این مطالعه شامل چهار ایزوله ایرانی پنوموکک Streptococcus pneumoniae 67H، S. pneumoniae 101H،S. pneumoniae 80H و S. pneumoniae110H که از آزمایشگاه رفرنس سلامت دریافت شده اند و نیز سویه هاي S. pneumoniae ATCC 49619 ، S. pneumoniae ATCC 6319 و S. pneumoniae 82218 میباشند.
کشت سویه هاي پنوموکک در محیط کشت تغییر یافته Hoeprich در دماي 37°C بصورت overnight انجام شد. ترکیب این محیط به ازاي یک لیتر محیط کشت به شرح ذیل میباشد :
براي اندازه گیري مقدار پلی ساکارید کپسولار از روش stains all استفاده شد .[17] براي این منظور سلولهاي باکتري کشت داده شده پس از جمع آوري با سانتریفوژ در بافر 150 mM Tris-HCl - pH 7 - -1 mM MgSO4 شستشو داده شدند و سپس در بافر مذکور پخش شدند. القاي اتولیز باکتریها با اضافه کردن دئوکسی کولیت در غلظت نهایی0.1% w/v به سوسپانسیون سلولی و انکوباسیون آن در دماي 37°C براي مدت 5 min انجام شد. سپس انکوباسیون نمونه ها با 100U از Mutanolysin، 50 ʽg ازDNAse I و 50 ʽg از Rnase A در دماي 37°C بصورت overnight انجام شد. انکوباسیون نمونه ها با 50 ʽg از Proteinase Kدر دماي 56°C براي مدت 4h ادامه یافت. بعد از مخلوط کردن 250 ʽl نمونه با 1 ml از محلول Stains-all که شامل 20 mg از ماده Stains-all و 60 ʽl از استیک اسید گلاسیال در 100 ml از فرمامید 50% است ، جذب نوري آنها در 640 nm معین شد.
سپس مقدار پلی ساکارید کپسولار در نمونه با توجه به جذب نوري معین شده براي هر نمونه و گراف استاندارد که در آن جذب نوري غلظتهاي معین از پلی ساکارید کپسولار خالص 19F اندازه گیري شده است، تعیین گردید. براي تعیین معنی دار بودن اختلاف در میزان تولید کپسول سویه ها از نظر آماري، تست توکی با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد.
2.5 OD 600 از سلولهاي پنوموکک کشت داده شده در محیط کشت تغییر یافته Hoeprich به ترتیب ذکر شده در فوق با استفاده از سانتریفوژ جمع آوري و پس از شستشو با استفاده از بافر Phosphate Buffered Saline - PBS - در بافرPBS حاوي 0.1% سدیم دئوکسی کولیت پخش شدند و انکوباسیون نمونه ها براي مدت یکساعت در دماي 37°C انجام شد. سپس آنالیز نمونه ها با استفاده از SDS-PAGE 10% و رنگ آمیزي با CBB-R250 صورت گرفت .
.3نتایج
نتایج اندازه گیري میزان کپسول تولیدي سویه هاي پنوموکک در جدول 1 ارائه گردیده است:
جدول -1 تولید کپسول بوسیله سویه هاي پنوموکک سروتیپ 19F
سویه S. pneumoniae 67H بالاترین میزان تولید کپسول را در میان ایزوله هاي ایرانی پنوموکک داشته است. اما سویه S. pneumoniae SSI 82218 بالاترین میزان تولید کپسول را در بین تمام سویه هاي مورد مطالعه دارا بوده است و میزان کپسول تولیدي آن 1.6 برابر سویه S. pneumoniae 67H بوده است. نتایج تست توکی نشان دهنده اختلاف معنی داردر میزان تولید کپسول دو سویه S. pneumoniae SSI 82218 وS. pneumoniae 67H بوده است. بنابراین سویه
بعنوان سویه برتر در ادامه این مطالعه مورد استفاده قرار گرفته است. در ضمن پروفیل پروتئینی این دو سویه بوسیله SDS-PAGE بررسی شده اند - شکل . - 1 نتایج ما نشان دهنده تفاوت در شدت دو باند مشاهده شده در این دو سویه در محدوده 99-100 kDa با توجه به مارکر میباشد .
شکل .1 مقایسه پروفایل پروتئینی سویه هاي پنوموکک. ستون 1، سویه S. pneumoniae 67H ;ستون 2، S. pneumoniae SSI ;82218 ستون M، مارکر. باندهاي با شدت متفاوت در این دو سویه با فلش بر روي شکل نشان داده شده اند.
