بخشی از مقاله
چکیده:
دی آسیل گلیسرول آسیل ترانسفراز، یک آنزیم میکروزومی است که نقش مهمی در متابولیسم گلیسرو لیپید دارد . این ژن نقش کلیدی در کنترل سنتز تریگلیسرید در سلولهای چربی دارد. این آنزیم مرحله نهایی سنتز تری گلسیریدهارا کاتالیز مینماید. برای بررسی تنوع ژنتیکی موجود در ژن DGAT1 از روش چند شکلی فضایی تک رشتهای - SSCP - DNA استفاده شد.
نتایج آنالیز باعث شناسایی سه الگوی در جایگاه ژن DGTA1 می باشد. میزان فراوانی ژنوتیپ ها برای ژنوتیپ I، II و III به ترتیب 0/56، 0/35، 0/10 بدست آمد. فراوانی ژنوتیپ ها انحرافی را از آزمون هاردی-واینبرگ نشان داد. وجود اختلاط و ترکیب جمعیت ها در منطقه و ایجاد جریان ژنی بالا احتمالا عامل اصلی عدم تعادل هاری-واینبرگ باشد. تنوع ژنتیکی مناسب با فراوانی نسبتا بالا و تنوع فنوتیپی بالا در جمعیت بز خلخالی نشان می دهد که می توان برای بهبود ژنتیکی بزهای خلخالی بهره برد.
مقدمه:
. بز خلخالی مانند سایر نژادهای بومی به شرایط اکولوژیکی مختلف مثل آب وهوا، بیماری ها و غذاهای منطقه کاملا سازگاری یافته و قادر است در شرایط سخت آب و هوایی زندگی کند. و در تعیین معیشت خانوار روستایی در منطقه نقش مهمی را ایفا می کند ولی به دلیل نبود کارهای اصلاح نژادی بازدهی کمی دارند. و اخیرا بحث دورگ گیری ای نژاد با نژاد های خارجی اصلاح نژاد مطرح شده و در حال اجرا می باشد که در صورت ادامه می تواند منجر به از بین رفتن نژاد خالص بومی شود. لذا بهتر است برای جلوگیری از بین رفتن نژادهای بومی سازگار به منطقه بایستی از لحاط بازدهی بهبود داده شود که یکی از سریعترین راهها استفاده از ژن های کاندیدا شناسایی شده است که ثابت شده بر روی صفات اقتصادی تاثیر معنی داری دارد. یکی از ژنهای مهم موثر بر صفات اقتصادی شیر ژن DGAT1 است.
ژن DGAT در پروژه نقشه یابی QTLهای برای درصدچربی و تولید شیر روی کرموزوم14 شناسایی شده است - - 1 بیش از 98 درصد چربی شیر از تری گلیسرید تشکیل شده است.چربی شیر نشخوارکنندگان دارای اسیدهای چرب کوتاه زنجیر 4 تا 6 کربنه هستند .تولید این اسیدهای چرب کوتاه زنجیر مستلزم اتصال اسیدهای چرب به موقعیت 3 می باشد .در اینجا آنزیم دی آسیل گلیسرول ترانسفراز به عنوان یک کاتالیزور عمل می کند و از این نظر قابل توجه و بیان کننده نقش مهم این آنزیم در تولید چربی شیر می باشد - 2 - در ژنDGAT 1 ایجاد یک جهش موثر از نوع تک نوکلئوتیدی باعث تبدیل گوانین به آدنین و در نتیجه منجر به جایگزینی لیزین با آلانین در موقعیت 232 اسید آمینه در این آنزیم میگردد. کهمتعاقباً باعث میزان تولید چربی و درصد پروتئین شیر بیشتر و همچنین تولید شیر و میزان پروتئین شیر کمتری خواهد شد
علاوه بر نقش مهم DGAT1 در سنتز تری گلیسریدها و ذخیره انرژی، این آنزیم در جذب چربی از روده، اتصال لیپید و پروتئین و تشکیل لیپو پروتئینها و تنظیم غلظت تری گلیسرید پلاسما، ذخیره چربی درسلولهای چربی و متابولیسم انرژی در ماهیچهو بلوغ زودرس باروری نیز نقش دارد - 5و. - 6 همچنین مشخص شده که DGAT1 به عنوان یک آنزیم مهم در تنظیم میزان تری گلسیریدها در بافت چربی می باشد . - 7 - ب ژن DGAT 1 به صورت یک همو تترامر در غشای شبکه آندوپلاسمی قرار دارد و دارای 17 اگزون و 16 اینترون و طول آن 10/62 کیلو باز میباشد و پروتئین تولید شده توسط این ژن دارای 500 اسیدآمینه است .یکQTL با اثر قوی بر صفات تولیدی شیر به خصوص محتویات چربی شیر در ناحیه 3 سانتی مورگان انتهای سانترومری کروموزوم 14 می باشد
با توجه به اهمیت ژن DGAT1 در سنتز چربی و تولید شیر، این مطالعه با هدف بررسی چندشکلی موجود در این ژن در جمعیت بزهای خلخالی و استفاده از برای بهبود صفات تلیدی مهم اقتصادی در آن انجام گرفت.
مواد وروش ها
نمونه گیری و استخراجDNA
در پژوهش حاضر بزهای نژاد خلخالی که دراستان اردبیل قرارداشته ودر شهر خلخال پرورش داده می شدند به صورت تصادفی تعداد 100 رأس انتخاب شدند ومورد مطالعه قرار گرفتند. نمونه های خون از سیاهرگ گردنی بزهای انتخاب شده تهیه شد. و پس از خون گیری نمونه ها خون در لوله های ونوجکت حاوی 50 میلی مول EDTAریخته شدند وبه آزمایشگاه انتقال داده شد.DNA ژنومیک با استفاده از کیت ATP bioscience استخراج گردید و با استفاده از روش الکتروفورز 0/8 درصد تعیین کیفیت گردید.
تکثیر و تعیین چندشکلی ژن دی اسیل گلیسرول ترانسفراز - - DGTA1
تکثیر قطعه 309 جفت بازی اگزون 17 ژن DGAT1 به کمک تکنیک PCR و با استفاده از پرایمر اختصاصی توالیهای زیر که توسط زو و همکاران - 9 - معرفی شدند انجام گرفت.
5´-GCA TGT TCC GCC CTC TGG-3´ :پرایمررفت 5´-GGA GTC CAA CAC CCC TGA-3´× :پرایمربرگشت برای تکثیر این جایگاه از پروتکل حرارتی PCR به شرح زیر انجام گردید: واسرشت سازی اولیه 94 درجه به مدت 5 دقیقه و 35 چرخه به ترتیب واسرشت سازی 94 درجه به مدت 1 دقیقه، اتصال پرایمرها 67 درجه به مدت 50 ثانیه و بسط 72 درجه به مدت 40 ثانیه و در نهایت بسط نهایی 72 درجه به مدت 10 دقیقه انجام گردید.
غلظت های مورد استفاده از مواد بعد از بهینه سازی برای انجام PCR به ترتیب 2/5 میکرولیترDNA ژنومی،3 میکرولتر از پرایمر،12/5میکرولیتر ازMIX MASTER، مابقی را تا رسیدن به حجم 25 L از آب مقطر استفاده شد.
برای تعیین ژنوتیپ و چندشکلی های موجود در ناحیه تکثیر شده از روش PCR-SSCP استفاده شد. تعیین ژنوتیپ محصولات بر روی ژل اکریل آمید 12 درصد آنجام گرفت .رنگ آمیزی به روش نیترات نقره انجام شد. سپس الگوهای مختلف باندی در ژن DGAT1 ارزیابی شدند.
نتیجه و بحث
قطعه 309 جفت بازی ژن اگزون 17 ژن DGTA1 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ذکر شده تکثیر گردید نتایج حاصل از آن بر روی ژل آگارز نشان می دهد که آغازگرها به صورت اختصاصی عمل کرده و ژن DGTA1 را به خوبی تکثیر کردند.
نتایج حاصل از PCR-SSCP ژن DGTA1 در بز های خلخالی منجر به شناسایی و تعیین ژنوتیب شدند که نتایج PCR-SSCP سه الگوی متفاوت را نشان دادند که همه باندها یک الگوی مشترک در ابتدای ژل دارند و براساس تفاوت در تعداد و الگوی باند ها موجود نام گذاری کردند - شکل - 1 وجود الگوهای متفاوت نشانگر نشان دهنده تنوع ژنتیکی و چندشکلی نوکلئوتیدی در جایگاه ژن DGTA1 می باشد - . - 10 میزان فراوانی ژنوتیپ ها برای ژنوتیپ I، II و III به ترتیب 0/56، 0/35، 0/10 بدست آمد. فراوانی ژنوتیپ ها انحرافی را از آزمون هاردی-واینبرگ نشان داد. که نشان دهنده وجود یکی هز عوامل بهم زننده تعادل می باشد که بنظر می رسد مهاجرت نقش مهمی داشته باشد به خاطر اینکه ترکیب و اختلاط جمعیت ها در ناحیه خیلی بالا است و جریان ژنی بالایی وجود دارد.
شکل:1الگوی باندهای مشاهده شده برای ژن DGTA1 باتکنیک PCR-SSCPدر بزهای نژاد خلخالی
گزارشات فراوانی مبنی بر تاثیر پلی مورفیسم های ژنتیکی ژن DGTA1 با تولید شیر، چربی و پروتئین وجود دارد با توجه به اینکه چندشکلی مناسبی در ناحیه اگزون 17 مشاهده شده است و گزارش هایی مبنی بر معنی دار بودن ناحیه اگزون 17ژن DGTA1 بر روی صفات شیر و وزن بدن شده است لذا می توان از چند شکلی های حاصل شده جهت بهبود صفات اقتصادی بزهای خلخالی استفاده کرد.
