بخشی از مقاله
مقدمه:
سالمونلوزیس یکی از بیماری های عمده ناشی از مواد غذایی است که اخیرا منجر به نگرانی هایی در سطح بهداشت عمومی شده است . - 1 - این باکتری با بیش از 2500 سروتیپ، جزء دومین موارد از بیماری های ناشی از مصرف مواد غذایی آلوده در آمریکا می باشد - 2 - و از بین سروتیپ های مختلف سالمونلا، سروتیپ های اینتریتیدیس و تیفی موریوم در مقام اول عفونت یا مسمومیت غذایی قرار دارند - 3 - و دارای شیوع گسترده ای در آسیا - کره، ژاپن و تایلند و ....می باشند - . - 4 اولین گزارش مربوط به شیوع مسمومیت غذایی ناشی از سالمونلا، توسط Gartner در سال 1888 در آلمان بود . - 5 - در مطالعات متعدد، شیوع آن %1.74 در آمریکا و %8.6 در ایران گزارش شده است 1 - و. - 6 آلودگی های انسانی از خوردن غذاهای خام از جمله گوشت، مرغ، تخم مرغ و غذاهای روزانه به وجود می آید. این باکتری تقریبا 25 میلیون عفونت و حدود 200000 مرگ را در سطح جهان ایجاد می نماید . - 7 -
با توجه به میزان مرگ و میر بالا، این مساله به عنوان خطری جدی تلقی می گردد نظر به پژوهش های محققین و اطلاعات آماری، محصولاتی از جمله مرغ، گوشت گاو، گوشت خوک، ماهی، شیر، تخم مرغ منشاء سالمونلوزیس های ناشی از مواد غذایی می باشند - . - 8 با توجه به این که سالمونلا به عنوان یک ارگانیسم مقاوم در مواد غذایی مطرح می باشد، آزمایشات میکروبیولوژی مواد غذایی برای حضور این پاتوزن الزامی است - . - 9 در حال حاضر، در آزمایشگاه های تشخیصی بر ای جستجوی بسیاری از میکروارگانیسم ها از روش های کشت میکروبی استفاده می شود. این روش در تشخیص آلودگی مواد غذایی به سالمونلا علاوه بر مشکلات انجام آزمایش و عدم دقت در پاسخ های حاصله، نیازمند مدت زمان زیادی جهت حصول به نتیجه نهایی است. در روش کشت میکروبی برای تشخیص آلودگی میکروبی مواد غذایی به سالمونلا تیفی موریوم 4 الی 6 روز وقت لازم است به علاوه حساسیت و دقت پاسخ های حاصله نیز پایین است . - 10 , 11 -
به منظور افزایش حساسیت و کاهش زمان انجام آزمون از روش های دیگری مانند جستجوی ژن های به مربوط به این میکروارگانیسم ها از طریق روش PCR عنوان روش جایگزین استفاده می شود .. - 12,13 - کنترل عفونت های سالمونلایی برای سلامت صنایع غذایی اهمیت دارد و معیارهای موثر کنترل و پیشگیری برای کاهش آلودگی سالمونلا با PCR باید انجام گیرد و این کنترل نیازمند روش هایی از جمله حساسیت متناوب برای شناسایی گونه های باکتریایی در نمونه های بالینی و غذایی می باشد با توجه به اهمیت آلودگی سالمونلا در مواد غذایی در بین مصرف کنندگان با خطر بالای بیماری مانند افراد مسن وکودکان بستری، هدف از این مطالعه جداسازی و شناسایی سروتیپ های سالمونلای جدا شده از شیر خام گاو در شهرستان شهرکرد با استفاده از روش مولکولی می باشد.
مواد و روش کار
در این تحقیق تعداد 550 نمونه شیر خام گاو، گوسفند و بز از مناطق مختلف شهرستان شهرکرد از مهر ماه تا اسفند ماه 1390 جمع آوری و در مجاورت یخ و در شرایط استریل به آزمایشگاه میکر بیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل گردید و مورد بررسی های میکروبیولوژی و مولکولی واقع گردیدند. برای این منظور 25 سی سی از نمونه شیر به 225 سی سی از میط کشت buffered peptone water - Merck - انتقال داده و در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت گرم خانه گذاری گردید. سپس 10 سی سی از این سوسپانسیون به محبط Selenit Cystine Broth - Merck - به عنوان محیط کشت غنی کننده منتقل گردید و به مدت 24 ساعت گرم خانه گذاری گردید. سپس یک لوپ از محیط غنی کننده در محیط - Salmonella Agar - Merck Shigella کشت داده شد و 24 ساعت در دمای 37 درجه گرم خانه گذاری شد. کلونی های شفاف و بی رنگ گاه با مرکز سیاه، رشد کرده در این محیط جهت تشخیص نهایی سالمونلا مورد آزمایش های بیوشیمیایی قرار گرفتند - . - 14
تعیین حساسیت ایزوله های سالمونلا به آنتی بیوتیک ها با استفاده از روش روش انتشار دیسک - کربی بایر - صورت گرفت. طبق دستورالعمل NCCLS از سوسپانسیون میکروبی هر سویه با کدورت 0/5 مک فارلند و با استفاده از سواپ استریل برداشت و به صورت فشرده بر روی محیط مولر هینتون کشت انجام شد و دیسک های مورد نظر با حفظ فاصله روی آن قرار داده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی گراد، بر اساس اندازه هاله های ممانعت از رشد، بر اساس جدول شرکت سازنده ثبت گردید. به منظور تشخیص سروتیپ تایفی موریوم DNA نمونه های مثبت شده در تست های بیوشیمیایی با استفاده از کیت استخراج DNA ساخت شرکت سیناژن استخراج گردید.
مراحل استخراج DNA باکتری با استفاده از کیت استخراج DNA به صورت زیر می باشد: ابتدا سوسپانسیون باکتری به مدت 10 دقیقه با دور 7500g سانتریفوژ شد سپس به سوسپانسیون باکتری 100 میکرولیتر پروتئاز اضافه گردید و در دمای 55 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در مرحله بعد به سوسپانسیون باکتری 300 میکرولیتر precipitation solution اضافه گردید. و به مدت 5 ثنیه ورتکس شد. محلول حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای -20 درجه سانتی گراد قرار گرفت و سپس به مدت 10 دقیقه با دور 12000g سانتریفوژ گردید. مایع رویی دور ریخته شد و به رسوب حاصله 1000 میکرولیتر washing buffer اضافه گردیدو به مدت 3-5 ثانیه ورتکس شد و در دمای 65 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه انکوبه گردید. سپس به رسوب حاصله 50 میکرولیتر Solvent buffer اضافه شد و در دمای 65 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه انکوبه گردید. در مرحله بعدبه مدت 30 ثانیه با دور 12000g سانتریفوژ شد. مایع رویی حاوی DNA در فریزر در -20 درجه سانتی گراد نگهداری شد. توالی های پرایمر مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است. جهت تشخیص سالمونلا تایفی موریوم از پرایمرهایfilC استفاده گردید - . - 15
نتایج:
در این تحقیق از مجموع 550 نمونه مورد بررسی، 20 نمونه در آزمون های میکروبی و بیوشیمیایی سالمونلا تشخیص داده شدند. که درصد آلودگی - %3.63 - برآورد گردید. به منظور بررسی سروتیپ تایفی موریوم از پرایمرهای filC استفاده گردید. که از 20 نمونه مثبت شده در بررسی های میکروبی 7 نمونه - %1.27 - در جضور پرایمر اختصاصی واکنش مثبت داشتند. مشاهده باند 559 bp نشان دهنده سروتیپ تایفی موریوم می باشد. نتایج در شکل 1 نشان داده شده است.
بحث:
سالمونلا یکی از مهم ترین علت های شیوع بیماری های ناشی از غذا در جهان است. مهم ترین سروتیپ جدا شده از انسان سالمونلا تیفی موریوم و انتریتیدیس است . - 16 - بنابراین، کنترل میکروبی مواد غذایی اهمیت خاصی دارد. عوامل میکروبی مختلفی می توانند موجب فساد مواد غذایی و بروز بیماری شوند. این باکتری سبب ایجاد بیماری های دستگاه گوارشی می شود و اصلی ترین راه انتقال آن به وسیله آب، گوشت، تخم مرغ و غذاهای خام می باشد - . - 17 سالمونلوز از بیماری های عفونی مشترک بین انسان و دام می باشد و افزایش شیوع آن بین انسان و حیوان ، مخصوصاً در دهه های اخیر، اهمیت بیماری را دو چندان می نماید. برای جلوگیری از آلودگی سالمونلا ، برنامه های نظارتی مورد نیاز است.
تحقیق نشان داد که شیوع آلودگی به سالمونلا در نمونه ها ی شیر خام شهرستان شهرکرد %4 می باشد. یکی از یافته های مهم مورد بررسی، آلودگی %1.71 سالمونلا تیفی موریوم در نمونه های شیر می باشد. در تحقیق انجام شده توسط نصرتی و همکاران در 1391 به منظور بررسی شیوع سروتیپ های سالمونلا تیفی موریوم، تیفی و اینتریتیدیس در مواد غذایی در مرکز درمانی بیمارستان مفید صورت گرفت آلودگی گوشت گاو به سالمونلا 8/8 درصد برآورد گردید - . - 16 در این تحقیق از گوشت مرغ باکتری سالمونلا جدا نگردید. در تحقیق انجام شده توسط رستگار و همکاران در 1387 ، که به منظور آلودگی به سالمونلا بر روی نمونه های شیر پاستوریزه صورت گرفت، آلودگی به این باکتری در نمونه های شیر مشاهده نگردید . - 17 -
سالمونلا انتریکا سرووار تایفی موریوم و سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از جمله سرووارهای بسیار مهم منتقله از راه مواد غذایی می باشند که در زمینه جداسازی این سرووارها تحقیقات متعددی صورت گرفته است. در بررسی انجام شده توسط جمشیدی و همکاران، در مشهد آلودگی به سالمونلا تایفی موریوم در لاشه های مرغ A1.6 گزارش گردید - . - 6 در تحقیق انجام شده توسط Rabie و همکاران در 2012 ذر یونان آلودگی به گونه های سالمونلا در جوحه های گوشتی %1.4، در گوشت مرغ فریز شده %4 و در افرادی که مسمومیت غذایی داشتند %10 گزارش گردید - . - 18 در صورتی که تحقیقات انجام شده در بلژیک نشان داد که آلودگی به سالمونلا در مرغ
