بخشی از مقاله
خلاصه
ایجاد مقاومت اختصاصی به ویروس با روشهاي بیوتکنولوژیکی امیدهایی براي کاهش خسارت ویروسها در سیب زمینی فراهم کرده است. ویروس X سیب زمینی از ویروسهاي بسیار مهم میباشد که باعث کاهش قابل توجه عملکرد این محصول در سراسر دنیا میشود. بررسی پروتئین هاي ممانعت کننده مکانیسم خاموشی بیان ژن - RNA Silencing - در ژنوم ویروس ها، ما را بر آن داشت که از ژن P25 ویروس PVX براي ایجاد مقاومت در سیب زمینی استفاده کنیم. براي این منظور با طراحی وکتور pFGC5491 و دو کلون کردن متوالی از یک قطعه از P25 در دو جهت متفاوت در آن، سازه سنجاق سري - hairpin - این قطعه ساخته شد و با آگروباکتریوم به گیاه منتقل گردید.
این سازه با القاء تولید siRNAهاي ویروسی در سیب زمینی، دفاع طبیعی ضد ویروسی ممتدي را ایجاد می کند. مطالعه گیاهان تراریخت با تکنیکهاي RT-PCR و ELISA نشان داد که همانند سازي ویروس در آنها در مقایسه با گیاهان تراریخت نشده به میزان قابل توجهی کاهش یافته و در برخی موارد مقاومت کامل به ویروس ایجاد شده است. این تحقیق در مقایسه با دستاوردهاي قبلی در ایجاد مقاومت به ویروس در سیب زمینی، از لحاظ استفاده از قطعه اي از ویروس که عامل ممانعت از RNA Silencing در آن میباشد تازگی دارد. در گیاهان تراریخت مکانیسم ضد ویروسی RNA Silencing براي PVX فعال شده و ویروس بخاطر مورد هدف قرار گرفتن از طریق ژن suppressor of - P25 - silencing نمیتواند مقاومت میزبان را شکست دهد. این روش ایجاد مقاومت قابلیت توسعه به دیگر ویروسها در تمامی گیاهان زراعی و باغی را دارد.
کلمات کلیدي: RNA Silencing، PVX، مقاومت، سیب زمینی، تراریخت
مقدمه
ویروسها در سیب زمینی بخاطر تکثیر رویشی این محصول باعث کاهش عملکرد آن از سالی به سال دیگر میشوند و در بین بیماریهاي گیاهی آن اهمیت بسزایی داشته و روش درمان موثري براي آنها وجود ندارد. از این رو تنها راه رهایی از خسارت آنها استفاده از بذر عاري از ویروس و کنترل ناقلین ویروسهاي گیاهی در مزرعه میباشد. اگرچه ژنهاي مقاومت در سیب زمینی در مقابل ویروسهاي آن شناسایی شده است اما استفاده از آنها در روشهاي اصلاح نباتات و یا بیوتکنولوژیکی تاکنون منجر به گزارش گیاهان مقاوم به ویروس با مقاومت کامل نشده است. ویروس PVX یکی از ویروسهاي بسیار مهم سیب زمینی میباشد که باعث کاهش قابل توجه عملکرد این محصول در سراسر دنیا میشود و دامنه میزبانی وسیعی دارد. همه نژادهاي PVX باعث ایجاد علائم موزائیک متوسط، mottling و کوتولگی میشوند.
ویروس PVX داراي ژنوم RNAي تک رشته اي Positive sense است و از پنج قاب قرائت باز تشکیل شده است. توالی هاي نوکلئوتیدي آن در بانک ژن ثبت شده است .[1]Post Transcriptional Gene Silencing یک مکانیسم عمومی در یوکاریوتهاست که قادر است بیان ژن هاي هدف را از طریق تجزیه mRNA آنها کاهش دهد. با گذشت زمانی چند از کشف مکانیسم RNA silencing ممانعت کننده هاي آن - Suppressors of RNA silencing - در گیاهان کشف شدند. ویروسها براي شکستن این دفاع ضد ویروسی طبیعی میزبانپروتئین هایی تولید میکنند که ممانعت کننده RNA silencing در میزبان هستند [3 ,2] و در واقع این پروتئین هاي ویروسی مانع از انجام این مکانیسم دفاعی گیاه علیه RNA هاي ویروس می شوند. در مورد ویروس PVX پروتئین P25 به عنوان ممانعت کننده RNA silencing شناخته شده است .[8- 4]
در سال 2008 گزارش شد که جهت ایجاد مقاومت به این ویروس براي قسمتی از ژن پروتئین پوششی ویروس، hairpin در گیاه ساخته شد و مشاهده شد که همانندسازي ویروس کاهش یافت .[1] با کشف عمل پروتئین P25 در ممانعت کننده گی از RNA silencing متوجه شدند که تمام تلاش هاي انجام یافته تا آن زمان براي ساخت گیاهان تراریخته مقاوم به ویروس بخاطر متوقف شدن RNA silencing توسط P25 بی ثمر بوده و انتظار مقاومت کامل در این گیاهان بیهوده است. چون با حمله ویروس سیستم دفاعی القا شده دیگر قادر به حفظ گیاه از آثار مخرب ویروس نخواهد بود. در این تحقیق با استفاده از قطعه اي از P25 مربوط به PVX و تولید ساختار hairpin آن و انتقال آن به سیب زمینی درصدد تولید گیاه مقاوم به این ویروس هستیم.
مواد و روش ها
با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی حاوي جایگاه هاي برشی 5’-XbaΙ-XhoI در پرایمر forward و 5’-BamHI-NcoI در پرایمرreverse، بخشی از ژن P25 ویروس PVX بطول 300 نوکلئوتید با PCR تکثیر یافته و دو مرحله کلونی کردن آن براي قرار گیري در Binary وکتور pFGC5941 انجام پذیرفت. در کلونینگ اول محصول PCR و وکتور خالی با آنزیمهاي NcoIو XhoI برش داده شد و بعد روي ژل آگارز LMP الکتروفورز شده و باندهاي مورد نظر از آن خالص سازي گردید. سپس طی واکنش لیگاسیون با استفاده از آنزیم T4 لیگاز محصول PCR برش یافته در وکتور خالی برش یافته با این دو آنزیم در جهت sense در بالادست اینترون CHS و پایین دست پروموتر 35S CaMV قرار گرفت.
بعد از ترانسفورم کردن E. coli کلنی هاي مثبت روي محیط LB حاوي کانامایسین انتخاب شده و وکتورهاي مثبت با انجام PCR با جفت پرایمري که اختصاصی وکتور در محل وارد شدن insert بود - شکل - 1 تائید شدند. یکی از کلنی هاي حاوي وکتور مثبت کشت شده و پلاسمید آن استخراج گردید. این پلاسمید به عنوان وکتور خالی براي کلونینگ مرحله دوم بکار رفت. در این مرحله مجددا PCR با پرایمرهاي اختصاصی مذکور صورت گرفت و این بار هم محصول PCR و هم وکتور با آنزیم هاي XbaI وBamHI تجزیه شدند. سپس خالص سازي از روي ژل انجام و با لیگاسیون قطعه P25 این بار در جهت آنتی سنس در پایین دست اینترون CHS وارد شد.
بعد از انتقال آن به باکتري با الکتروپوراسیون، کلونیهاي مثبت روي محیط حاوي کانامایسین انتخاب شدند و وجود دو قطعه P25 در دو جهت مخالف هم در وکتور نهایی با PCR - شکل - 2بکمک پرایمرهاي وکتور و همچنین تجزیه آنزیمی اثبات گردید و در مرکز توالی یابی انستیتو IBMP در استراسبورگ فرانسه توالی آنها تایید شدند. این وکتور نوترکیب حاوي ساختار سنجاق سري قطعه اي از P25 میباشد که با الکتروپوراسیون به آگروباکتریوم منتقل شد تا از آن براي ترانسفورم کردن گیاهان سیب زمینی رقم آگریا استفاده شود. گیاهان تراریخت حاصل توسط PVX تلقیح شده و با RT-PCR و ELISA براي بررسی مقاومت به ویروس مطالعه و با گیاهان تراریخت نشده و همچنین گیاهان تراریخت شده با وکتور خالی مقایسه شدند.
نتایج و بحث
RNA هاي دو رشته اي 21 تا 23 نوکلئوتیدي که siRNA نام دارند جزء کلیدي و راه انداز ماشین RNA silencing هستند. براي تولید گیاهان سیب زمینی مقاوم به ویروس PVX، در این مطالعه القاء تولید siRNA پروتئین P25 از این ویروس اساس کار قرار گرفت. یک ساختار سنجاق سري از قطعه اي از P25 در یک T-DNA تحت پروموتور 35S تهیه و توسط آگروباکتریوم به سیب زمینی منتقل گردید تا مدام به تولید siRNA ویروسی آن هم براي ژن P25ویروس بپردازد. پس از تولید کالوس، جوانه و ریشه و باززایی گیاهان تراریخته، تکثیر آنها در شرایط درون شیشه اي صورت گرفته و تعدادي از انها براي بررسی مقاومت به ویروس PVX مورد استفاده قرار گرفتند. بین دو تا سه هفته پس از تلقیح مکانیکی ویروس، استخراج پروتئین براي تست DAS-ELISA به کمک آنتی بادیهاي اختصاصی ویروس و همچنین استخراج RNA براي تست RT-PCR به کمک پرایمرهاي اختصاصی ویروس انجام گرفت. نتایجنشان داد که گیاهان تراریخته مقاومت تقریبا کاملی به ویروس دارند. گیاهان تراریخت نشده سیب زمینی و همچنین
