بخشی از مقاله
خلاصه:
به منظور مطالعه ژنوم کامل ویروس V سیب زمینی - PVV - و مقایسه جدایه ایرانی این ویروس با تنها جدایه گزارش شده در دنیا، یک نمونه آلوده به این ویروس با علائم موزائیک و ایجاد لکه هاي نکروز در سطح برگ ها از مزارع کشت سیب زمینی در منطقه بردسیر کرمان جمع آوري و آلودگی آن به PVV به وسیله آزمون الایزا - ELISA - با آنتی سرم چند همسانه اي تائید شد. پس از آن جدایه مذکور بر روي توتون هاي رقم Nicotiana debneyii و Nicotiana tabacum var. samsun NN. تکثیر گردید. آر.ان.اي این جدایه استخراج و با کمک جفت آغازگرهاي اختصاصی قطعاتی به طول هاي 816، 1557، 738، 564، 156، 1902، 156، 1074 ،1368 و 340جفت باز به ترتیب مربوط به ژن هايNIa ,NIb ,CP، VPg، 6k2، ، CI، 6k1، HC-Pro ,P3 و ناحیه NTR 3′ ویروس تکثیر شد.
از محصولات RT-PCR جهت همسانه سازي با کمک باکتري Escherichia coli استرین XL-blue و پلاسمید pTZ استفاده شد. پس از تعیین ترادف نوکلئوتیدي و اسید هاي آمینه، ترادف ژن هاي مذکور با استفاده از نرم افزار DNAMAN با تنهاجدایه گزارش شده از کشور اسکاتلند موجود در بانک ژن - DV42: Accession no AJ243766 - مقایسه شدند. در این مقایسه ژن هاي CP، NIb، NIa، 6k1، VPg، CI، 6k2، P3 و HC-Pro جدایه ایرانی و جدایه DV 42 به ترتیب 96/4، 92/8، 94، 91/5، 95/7، 93، 94/8، 93/6 و84/1 درصد براي ترادف نوکلئوتیدي و 96/6، 94/2، 95/2، 100/5،93، 98/5، 100، 97/2 و85/2 در صد براي ترادف اسید هاي آمینه شباهت داشتند. میزان تشابه ترادف نوکلئوتیدي ناحیه 96/2 3′ NTR در صد تعیین گردید. این نتایج بیانگر آن است که دو جدایه ایرانی و اسکاتلندي از نظر میزان ترادف نوکلئوتیدي نزدیک به هم هستند.
مقدمه
ویروس V سیب زمینی از جنس پوتی ویروس - Potyvirus - وخانواده پوتی ویریده - Potyviridae - می باشد. پیکره هاي آن شامل یک کپسید باتقارن شش وجهی و ژنوم آن رشته اي خمش پذیر با طول 760 نانومتر می باشد - . - 4 آر.ان.اي ویروس V سیب زمینی تک لا، مثبت وبصورت تک رشته اي بوده که حاوي9851 نوکلئوتید می باشد - . - 2 این ویروس داراي یک قاب خواندنی بزرگ - ORF - بوده، که قسمت هاي اصلی ژنوم آن به ترتیب Viral - VPg - Protein genome، منطقه ترجمه نشده - Non translated region - غنی از اوراسیل وآدنین، یک قاب خواندنی بزرگ متشکل از9201 نوکلئوتیدکه به یک پلی پروتئین بزرگ ترجمه شده و منطقه ترجمه نشده NTRَ3 می باشد.
ژنوم این ویروس شبیه سایر اعضاي این گروه به روش پلی پروتئین ترجمه می شود . - 3 - در این حالت ابتدا ORF ویروس به یک پلی پروتئین بزرگ ترجمه می شود، سپس این پلی پروتئین تحت تاثیر 3 پروتئازویروسی به پروتئین هاي کوچکترکه داراي وظایف خاص هستند تقسیم می گردد. پروتئاز P1 محل برش آن P1-HC است، پروتئاز HC-Pro محل برش آن HC-P3 وپروتئاز NIa که پروتئاز عمده است داراي هفت مکان برشی می باشد.
پروتئین هاي CP، NIb، NIa و CI حاصل این برش ها بوده و پروتئازها با برش هاي بیشتر بر روي پلی پروتئین، پروتئین هاي VPg ، 6K1 و 6K2 را تولید می نمایند - . - 1 براساس گزارشات موجود این ویروس از گسترش کمی در مزارع سیب زمینی برخوردار است و دامنه میزبانی آن نیز محدود به سیب زمینی می باشد . در این بررسی سعی گردید مشخصات مولکولی یک جدایه از این ویروس که از منطقه اي بردسیر کرمان بدست آمده است مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روش ها
به منظور بررسی پراکندگی ویروس V سیب زمینی در طول سالهاي زراعی 1386 تا 1387 از مزارع سیب زمینی استان هاي کرمان و همدان نمونه برداري بعمل آمد. نمونه برداري در مزارع این استانها به صورت تصادفی و براساس علائم بیان شده جهت ویروسV سیب زمینی و سایر ویروس هاي آن انجام شد. به منظور بررسی وجود آلودگی ویروسی در نمونه ها، آزمون هاي الیزا نسبت به PVV براساس روش کلارك و آدامز و به روش ساندویچ دوطرفه - DAS ELISA - با استفاده از آنتی بادي هاي چند همسانه اي صورت گرفت.
از بین نمونه هاي مورد بررسی تنها یک نمونه در آزمون الیزا واکنش مثبت نشان داد که جدایه مذکور بر روي توتون هاي رقم Nicotiana debneyii و Nicotiana tabacum var. samsun NN. تکثیر گردید. آر. ان. اي این جدایه استخراج و با کمک جفت آغازگرهاي اختصاصی به ترتیب مربوط به ژن هايNIa ,NIb ,CP، VPg، 6k2، ، CI، 6k1، HC-Pro ,P3 و ناحیه 3 NTR ویروس تکثیر شد. از محصول هاي RT-PCR جهت همسانه سازي با کمک باکتري Escherichia coli استرین XL-blue استفاده شد. . پس از تعیین ترادف نوکلئوتیدي و اسید هاي آمینه، توالی ژن هاي مذکور با استفاده از نرم افزار DNAMAN با تنهاجدایه گزارش شده از کشور اسکاتلند موجود در بانک ژن - DV42: Accession no AJ243766 - مقایسه شدند.
نتایج و بحث
الکتروفورز محصول PCR مربوط به ژن هاي CP ، NIb ، NIa، 6k1، VPg، CI، 6k2، P3 و HC-Pro به ترتیب منجر به تشکیل باندهائی به طول 816، 1557، 738، 564، 156، 1902، 156، 1074 ،1368 و 340جفت بازگردیدند. در جریان همسانه سازي قطعات مذکور مستقلا در پرگنه هاي سفید ترانسفورم شده با استفاده از آزمون PCR شناسایی گردیدند. هضم آنزیمی پلاسمیدهاي نوترکیب با استفاده از آنزیم هاي EcoRI وPstI نیز نتایج فوق را تایید نمودند. از آنجائیکه یک ژنوم کامل از این ویروس در بانک ژن موجود می باشد، لذا ژن هاي متعدد تکثیر شده جدایه ایرانی PVV با تنها ژنوم گزارش شده در دنیا مقایسه گردیدند.
مقایسه ژن هاي CP ، NIb ، NIa، 6k1، VPg، CI، 6k2، P3 و HC-Pro جدایه ایرانی با جدایه DV42 به ترتیب96/4، 92/8، 94، 91/5، 95/7، 93، 94/8، 93/6 و84/1 درصد ترادف نوکلئوتیدي و 96/6، 94/2، 95/2، 100/5،93، 98/5، 100، 97/2 و85/2 درصد ترادف اسید هاي آمینه را نشان دادند. در مورد ناحیه 3′ NTR نیز میزان تشابه 96/2 در صد می باشد. درمورد ژن CP که ترادف هاي زیادي از آن در Gen Bank موجود است جدایه ایرانی به ترتیب یشترین و کمترین درصد تشابه نوکلئوتیدي را با جدایه هاي گزارش شده از کشور سوئد - - Swedish و پرو - - PA1.1 به میزان 96/8 و 89/6 درصد نشان داد.
همچنین بر اساس نتایج به دست آمده بیشترین و کمترین درصد تشابه اسیدآمینه هاي جدایه ایرانی با جدایه هاي گزارش شده از کشور هاي سوئد - Swedish - و پرو - PA1.1 - به ترتیب به میزان 98/8 و 95/5 درصد می باشد. نتایج حاصل بیانگر آن است که در مقایسه بین جدایه ایرانیPVV و جدایه DV42 از کشور اسکاتلند ژن هاي CP، 6k1 و6k2،از همولوژي بالاتري نسبت به بقیه ژن هاي این ویروس برخوردار می باشند.
