بخشی از مقاله
چکیده
به منظور بررسی چند شکلی جایگاه ژنی کالپاستاتین, از تعداد 250 رأس گوسفند کرمانی و 100رأس گوسفند سنجابی به طور تصادفی خونگیری شد. نمونه های DNA از خون کامل استخراج شد و واکنش زنجیره ای پلی مراز - PCR - برای تکثیر قطعه 622 جفت بازی با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی انجام گرفت. برای مشاهده قطعات حاصله از ژل آگارز و اتیدیوم بروماید استفاده گردید. فراوانیهای آللی و ژنوتیپی a ، b در نژاد کرمانی به ترتیب 0/40، 0/6و در نژاد سنجابی به ترتیب0/47، 0/53مشاهده شدند. نتایج نشان دادند که تعادل هاردی-واینبرگ در جمعیتهای مورد مطالعه برقرار بود . - 3 0/05 - متوسط هتروزیگوسیتی برای نژادهای کرمانی و سنجابی به ترتیب 0/55، 0/62 به دست آمد.
مقدمه
ژن کالپاستاتین به طول 100 کیلو جفت باز بر روی کروموزوم شماره 5 گوسفند قرار دارد و در مطالعات مربوط به افزایش وزن و کیفیت گوشت به عنوان ژن کاندیدا شناخته شده است 6 - ، 3 و . - 7 گزارشات متعددی، وجود ارتباط بین سطح کالپاستاتین در عضله و تردی گوشت را تایید می کنند 2 - و . - 9 هر چند تحقیقات بسیاری رابطه بین چند شکلی این ژن و صفات کیفیت لاشه را نشان داده اند، در عین حال در برخی از گزارشات رابطه بین چند شکلی این ژن و صفات رشد در گوسفند نیز مورد بررسی قرار گرفته است . - 8 - سیستم پروتئازی کالپین - کالپاستاتین جزء پروتئازهای طبیعی وابسته به کلسیم است که در شکل گیری و تجزیه بافت عضلانی، نرمی و تردی گوشت بعد از کشتار و باروری نقش مهمی دارد. کالپاستاتین اولین مهار کننده اختصاصی مولکول کالپین است 4 - ، 5 و . - 10 ژن کالپاستاتین درسیستم RFLP دارای دو آلل a، b و همچنین سه ژنوتیپ aa، ab، bb می باشد 6 - و . - 7 هدف از این مقاله بررسی فراوانی آللی و ژنوتیپی جایگاه ژنی کالپاستاتین به روش RFLP در نژادهای کرمانی و سنجابی می باشد.
مواد و روش ها
چکیده
به منظور بررسی چند شکلی جایگاه ژنی کالپاستاتین, از تعداد 250 رأس گوسفند کرمانی و 100رأس گوسفند سنجابی به طور تصادفی خونگیری شد. نمونه های DNA از خون کامل استخراج شد و واکنش زنجیره ای پلی مراز - PCR - برای تکثیر قطعه 622 جفت بازی با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی انجام گرفت. برای مشاهده قطعات حاصله از ژل آگارز و اتیدیوم بروماید استفاده گردید. فراوانیهای آللی و ژنوتیپی a ، b در نژاد کرمانی به ترتیب 0/40، 0/6و در نژاد سنجابی به ترتیب0/47، 0/53مشاهده شدند. نتایج نشان دادند که تعادل هاردی-واینبرگ در جمعیتهای مورد مطالعه برقرار بود . - P 0/05 - متوسط هتروزیگوسیتی برای نژادهای کرمانی و سنجابی به ترتیب 0/55، 0/62 به دست آمد.
مقدمه
ژن کالپاستاتین به طول 100 کیلو جفت باز بر روی کروموزوم شماره 5 گوسفند قرار دارد و در مطالعات مربوط به افزایش وزن و کیفیت گوشت به عنوان ژن کاندیدا شناخته شده است 6 - ، 3 و . - 7 گزارشات متعددی، وجود ارتباط بین سطح کالپاستاتین در عضله و تردی گوشت را تایید می کنند 2 - و . - 9 هر چند تحقیقات بسیاری رابطه بین چند شکلی این ژن و صفات کیفیت لاشه را نشان داده اند، در عین حال در برخی از گزارشات رابطه بین چند شکلی این ژن و صفات رشد در گوسفند نیز مورد بررسی قرار گرفته است . - 8 - سیستم پروتئازی کالپین - کالپاستاتین جزء پروتئازهای طبیعی وابسته به کلسیم است که در شکل گیری و تجزیه بافت عضلانی، نرمی و تردی گوشت بعد از کشتار و باروری نقش مهمی دارد. کالپاستاتین اولین مهار کننده اختصاصی مولکول کالپین است 4 - ، 5 و . - 10 ژن کالپاستاتین درسیستم RFLP دارای دو آلل a، b و همچنین سه ژنوتیپ aa، ab، bb می باشد 6 - و . - 7
هدف از این مقاله بررسی فراوانی آللی و ژنوتیپی جایگاه ژنی کالپاستاتین به روش RFLP در نژادهای کرمانی و سنجابی می باشد.
مواد و روش ها
از تعداد 250 رأس گوسفندان کرمانی و 100 رأس گوسفند سنجابی بطور تصادفی خونگیری به عمل آمد. برای جلوگیری از انعقاد خون از لوله های حاوی EDTA استفاده شد و نمونه ها تا زمان استخراج DNA در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. استخراج DNA از 50 میکرو لیتر خون کامل و به کمک روش ایزوتیوسیانات گوانیدین-سیلیکا ژل - بوم و همکاران، - 1990 و با استفاده از کیت Diatom DNA Prep 100 - ساخت شرکت ژن فن آوران - انجام گرفت. کمیت و کیفیت DNA به دست آمده با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد.
برای انجام PCR از یک جفت آغازگر به شرح زیر استفاده شد:
C: CAST1 5َ3 - TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG -
D: CAST1 5َ3 - GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC - َ
حجم نهایی واکنش 25 میکرو لیتر می باشد که شامل: یک میکرو لیتر DNA استخراج شده با غلظت 50 تا 100 نانوگرم، سه میکرو لیتر مخلوط آغازگرها با غلظت 5 پیکامول بر میکرولیتر، ده میکرو لیتر diluent، هشت میکرو لیتر آب دو بار تقطیر و سه میکرو لیتر Master Mix بود. برای انجام PCR از دستگاه ترموسایکلر استفاده شد. برنامه حرارتی مورد استفاده شامل: 35 مرحله با دمای واسرشت اولیه 95C به مدت سه دقیقه, دمای واسرشت 95C به مدت یک دقیقه، دمای اتصال 62C به مدت 45 ثانیه، دمای تکثیر 72C به مدت 90 ثانیه و دمای تکثیر نهایی 72C به مدت 10 دقیقه بود. صحت قطعه به دست آمده از محصول PCR بر روی ژل آگارز 1/5 درصد و رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید و سایز مارکر M 100 با ولتاژ 80 ولت و به مدت 20 دقیقه مورد تایید قرار گرفت.
برای انجام RFLP از ژل آگارز 2 درصد متصل استفاده شد.
به این منظور دو میکرو لیتر از محصول PCR به مدت 5 دقیقه در دمای 95C در دستگاه PCR قرار داده شد. سپس نمونه ها به سرعت و به مدت 10 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد تا از اتصال مجدد رشته های مکمل به یکدیگر ممانعت به عمل آید. مقدار 4 میکرولیتر از این نمونه ها در چاهک ها ریخته و به مدت 8 ساعت در ولتاژ 200 ولت قرار گرفتند. رنگ آمیزی به روش اتیدیوم بروماید انجام شد و ژنوتیپ ها تعیین گردیدند. برای عکس برداری از دستگاه Gel Documention شرکت کیاژن استفاده شد. جهت تست برقراری تعادل هاردی-وینبرگ، فراوانی آللی و ژنوتیپی و شاخص هتروزیگوسیتی از نرم افزار PoPGene استفاده شد.
نتایج و بحث
چند شکلی - RFLP - جایگاه ژنی کالپاستاتین در دو نژاد کرمانی و سنجابی که شامل ژنوتیپهای aa، ab، bb بود، بطور موفقیت آمیزی انجام شد - شکل. - 1 نتایج فراوانیهای آللی و ژنوتیپی و آزمون کای مربع برای ژنوتیپهای این جایگاه ژنی در جدول 1 ذکر گردیده است. در هر دو نژاد ژنوتیپ aa وآلل a دارای بیشترین فراوانی بودند. نتایج مشابهی نیز توسط پالمر و همکاران - 6 - در نژادهای دورست دون و کوپ ورث گزارش گردیده است. از بین ژنوتیپهای ممکن برای دو آلل جایگاه ژنی کالپاستاتین، ژنوتیپ bb,aa در دو نژاد مشاهده شدند. در عین حال پالمر و همکاران - 8 - این ژنوتیپها را در گوسفند دورست دون مشاهده، ولی ژنوتیپ ab را در آمیخته دورست دون با کوپ ورث مشاهده نکردند. این تفاوت می تواند تاثیر گذاری عوامل مختلف چون تفاوتهای نژادی و تعداد دام مورد مطالعه باشد.
