بخشی از مقاله
چکیده
طی بازدیدهای به عمل آمده در سال 1391 از مزارع هندوانه در استان خراسان رضوی از بوته های هندوانه دارای علائم پژمردگی، لکه های آبسوخته، کلروزه و یا نکروزه در مناطق عمده کشت این محصول در استان خراسان رضوی، نمونه برداری به عمل آمد. نمونه ها به آزمایشگاه انتقال یافته و قطعاتی از حد فاصل قسمت آلوده و سالم جدا و عصاره بافتهای آلوده روی محیط غذایی حاوی آگار کشت شدند. پس از جداسازی باکتری ها، شناسایی آنها با آزمون های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی لازم صورت گرفت. کلونی برخی از باکتری ها روی محیط آگار غذایی قرمز، برجسته و لعاب دار بود. این باکتری ها گرم منفی، گرد، متحرک، بی هوازی اختیاری، کاتالاز مثبت و واکنش اکسیداز آنها منفی بود. بیماری زایی جدایه ها با مایه زنی روی برگ های هندوانه به اثبات رسید. براساس مجموع خصوصیات مرفولوژیکی، بیوشیمیایی، فیزیولوژیکی، بیماریزایی و با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلی مراز - PCR - به کمک آغازگرهای اختصاصی این جدایه های بدست آمده از هندوانه به عنوان گونه Serratia marcescens شناسایی شدند.
واژه های کلیدی: هندوانه، خراسان رضوی، Serratia marcescens
مقدمه
زوال رگبرگی هندوانه بعنوان بیماری رگبرگ زردی هندوانه - Citrullus Yellow Vine Disease - شناخته می شود .[14] این بیماری اولین بار در سال 1988 در کدو مسما و کدو تنبل - Cucurbita spp. - رداُکلاهما و تگزاس .[1] و سپس در سال 1991 در مزارع هندوانه - Citrullus lanatas - و طالبی گزارش گردید .[2] و بعد از آن این بیماری در میسوری [9]، کلرادو و ماساچوست [3] و تنسی [5] مشاهده گردید.عامل بیماری رگبرگ زردی هندوانه یک باکتری سخت رشد محدود به آوند آبکش است کهفعلاً به عنوان Serratia marcescens شناسایی شده است .[20]علائم این بیماری بصورت کوتولگی، زردی و زوال تدریجی است که حدوداً 10 تا 14 روز قبل از برداشت محصول شروع می شود.
ممکن است موقع گلدهی یک پژمردگی سریع رخ دهد که بدنبال آن گیاه متلاشی می شود. علامت مشخص این بیماری قهوه ای شدن آوند آبکش است که تغییر رنگ آوند آبکش در سیستم ریشه و طوقه مشاهده می شود .[2] این بیماری در سایر کدوئیان شامل کدو مسما، کدو تنبل، هندوانه و طالبی نیز مشاهده شده است .[12] تلفات حاصل از این بیماری از کمتر از 5 درصد تا 100 درصد در مزارع هندوانه، طالبی و کدو تنبل گزارش شده است .[3] این گزارش نتایج بررسی هایی است که در زمینه جداسازی و شناسایی جدایه های عامل بیماری زوال رگبرگی هندوانه انجام شده است.
مواد و روش ها
الف- جداسازی، نگهداری جدایه ها و بررسی خصوصیات فنوتیپی
جهت جداسازی عامل بیماری، ابتدا برگهای آلوده زیر جریان شیرآب معمولی به منظور حذف گرد و غبار و عوامل ساپروفیت به طورکاملشسته شدند. سپس دوبار نیز جهت احتیاط با آب مقطر سترون شستشو و بعداً به درون ظروف پتری استریل که هم حجم آنها آب مقطر سترون اضافه می گردید، منتقل شدند. توسط اسکالپل استریل، نمونه ها درون آب مقطر خرد گردیده و بعد از 15-10 دقیقه، 1-2 لوپ، از سوسپانسیون حاصله بر روی محیط آگار غذایی که در شرایط استریل و روز قبل تهیه گردیده بود، مخطط گردید. با نگهداری کشت ها به مدت 2-3 روز در دمای 28 درجه سانتیگراد و پس از رشد کامل، تک کلنی ها بر روی محیط YDC و KB دوباره مخطط گردید.
آزمون هوازی یا بی هوازی بودن - O/F - به روش هیو و لیفسون [6] و تعیین واکنش گرم باکتری ها با حلالیت در پتاس - KOH - سه درصد به روش ساسلو [17] انجام شد . آزمون هیدرولیز آژرنین به روش تورنلی [19] انجام شد . برای بررسی استفاده استرینهای باکتری از کربوهیدراتهای مختلف شامل گلوکز، فروکتوز، گالاکتوز، سوکروز و لاکتوز از محیط پایه آیر - 1969 - استفاده شد. آزمون لوان به روش لیلیوت و استید [10]، اکسیداز به روش کواکس [7]، هیدرولیز توئین 80 به روش سیرا [18] و سایر آزمون های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و تغذیه ای باکتری های جدا شده بر اساس روش های معمول باکتریولوژیکی [15] انجام گرفت. آزمون فوق حساسیت در شمعدانی و توتون نیز به روش کلمنت و همکاران [8] انجام شد.
ب- بیماریزایی
برای بررسی شدت بیماری زایی باکتری روی هندوانه از روش بروتون و همکاران [3] با اندکی تغییرات استفاده شد. آزمون بیماریزایی با کاشت بذور هندوانه در گلخانه و مایه زنی سوسپانسیون باکتری به برگ آنها مورد بررسی قرار گرفت . بذور هندوانه پس از ضدعفونی سطحی داخل بستر کوکوپیت در محلی تاریک در دمای اتاق نشا شدند. در مرحله دو برگی نیز در گلدان هایی با قطر 10 سانتی متر کشت شدند. برای بررسی بیماری زا بودن استرین ها پس از چند برگی شدن گیاهچه ها آزمون بیماریزایی به دو روش تزیق با سرنگ و محلول پاشی بر روی برگ انجام شد.
در روش اول از کشت تازه جدایه ها سوسپانسیون باکتری با چگالی نوری یک واحد OD600=1 تهیه شده و تلقیح با مایه زنی 20-30 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری با غلظت 108 سلول در میلی لیتر انجام شد و بوسیله سرنگ های بدون نوک به سطح پایین برگ تزریق گردید . تزریق به هر منطقه به نحوی بود که حدود 1 تا 1/5 سانتیمتر از بافت آبسوخته می شد. در روش دوم سوسپانسیون باکتری روی برگ های یک بوته محلول پاشی شد و سپس برگ ها با فرو بردن چند سنجاق زخم گردید. نتایج تا دو هفته بر روی گیاه هندوانه مورد بررسی قرار گرفت. به منظور افزایش رطوبت محیط و سطح گیاه، هر دو روز یک بار با آب مقطر مه پاشی می شد و پوشش پلاستیکی روی آنها کشیده شد. ظهور لکه های آبسوخته بعد از 4 الی 6 روز نشانه مثبت بودن تست بیماری زایی بود.
ج- تعیین دامنه میزبانی باکتری در شرایط گلخانه
جهت بررسی دامنه میزبانی این جدایه ها در شرایط گلخانه از 6 واریته گیاهی متعلق به خانواده کدوئیان شامل کدو مسما، کدوحلوایی، هندوانه، طالبی، خربزه و خیار استفاده گردید. تا حد ممکن سعی شد که از هر میزبان حداقل 10 عدد به صورت کشتهای گلدانی پرورش یابند و این گیاهان در شرایط مناسب توسط باکتری مایه زنی شدند. مایه زنی باکتری به روش انتقال مکانیکی انجام گرفت. مشاهدات دقیق، جهت بررسی علائم و تغییرات ایجاد شده در گیاهان مورد بررسی انجام گرفت.
د- بررسی مولکولی و واکنش زنجیره ای پلی مراز PCR
استخراج DNA به روش مانسوا و همکاران انجام شد .[11] آغازگرهای اختصاصی Gammaproteobacter - SSU primers - برای تشخیص باکتری های Serratia مورد استفاده و ارزیابی قرار گرفتند.به منظور بررسی قطعات تکثیر شده، ژل آگارز 1/5 درصد تهیه و مقدار 5 l از محصول PCR به همراه 1ʽl بافر بارگذاری در چاهک تزریق شد. سایز مارکر مورد استفاده در آزمون 1Kb بود که به عنوان وزن مولکولی استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. عمل الکتروفورز به مدت یک ساعت با ولتاژ 100 ولت انجام شد در فرایند رنگ آمیزی ژل آگارز، از رنگ جایگزین اتیدیوم بروماید با نام DNA green viwer استفاده شد . برای صحت انجام آزمایش و کنترل آلودگی، در یک واکنش بجای افزودن DNA ژنومی از آب مقطر سترون - بعنوان شاهد منفی - در کنار سایر نمونه ها استفاده شد. در انتها با استفاده از دستگاه Gel Documentation از ژل عکسبرداری صورت گرفت .[13]پس از تکثیر قطعه ای از ناحیه 16S rDNA، نمونه هایی که باند در محدوده 950 جفت باز را در الکتروفورز نشان دادند، برای توالی یابی به شرکت ماکروژن در کره جنوبی فرستاده شدند.
نتیجه گیری
الف- جداسازی و تعیین خصوصیات باکتریولوژیک
دو روز پس از کشت سوسپانسیون تهیه شده از برگ های مبتلا، کلنی های مدور، برآمده و صاف، کامل، لعابدار، برنگ قرمز خونی با حاشیه سفید و به اندازه تقریبی 1.5-2میلی متر روی محیط آگار غذایی ظاهر شدند - شکل . - 1 لازم به ذکر است مورفولوژی کلنی ها روی محیط EMB به رنگ سبز متالیک با حالت درخشنده بود. واکنش فوق حساسیت در توتون و شمعدانی در این جدایه ها مثبت بود. جدایه های مورد بررسی در آزمون لیپاز بعد از 24 ساعت قادر به تشکیل هاله سفید رنگی در اطراف کلنی خود بودند که این ویژگی دال بر توانایی تولید آنزیم لیپاز توسط این جدایه ها بود. همچنین جدایه های مورد بررسی در آزمون هیدرولیز کازئین قادر به تولید آنزیم کازئیناز بوده و در نتیجه در اطراف کلنی خود هاله شفافی ایجاد نمودند.جدایه ها به تتراسایکلین و آمپی سیلین مقاومت و نسبت به آنتی بیوتیک جنتامایسین حساسیت نشان دادند. سایر خصوصیات فنوتیپی باکتری در جدول شماره یک نشان داده شده است.
